早产儿氟康唑2D-HPLC血药浓度测定方法研究

王颖，曾含清，肖轶雯，原海燕，刘文辉，罗芝英*，王峰*（1.中南大学湘雅二医院药学部，长沙 410011；2.中南大学临床药理研究所，长沙 410011；.中南大学湘雅三医院药学部，长沙 410015）

氟康唑是新一代三唑类抗真菌药物，作为新生儿预防和治疗侵袭性真菌感染的一线用药，在临床广泛使用。但是最近有文献报道，常规给药方案会增加真菌定植的风险，并且可能导致新生儿重症监护室（neonatal intensive care unit，NICU）真菌感染率和耐药率上升[1-4]；因此对新生儿氟康唑进行血药浓度监测（TDM），可以帮助临床判断预防用药时体内浓度及其浓度变化模型，评估氟康唑临床疗效，降低病房真菌感染率和耐药率。

新生儿与儿童、成人相比，体表面积更大、皮下脂肪组织更薄、血容量更少[5-6]，考虑到患儿血常规、肝肾功能、感染指标测评等需要一定血样量，因此能供血药浓度监测的血样量很少；另外临床主要采用平卧位采血，患儿血容量多集中于躯干及内脏，足末梢的血循环相对较差，以致需要反复挤压或者多次穿刺获得血标本，这样不仅采血量不足，还增加了感染的风险[6-7]。因此建立微量血液的测定方法十分必要。

血药浓度测定属于临床检验范畴，评估及时性的标准指标为“检验结果回报时间”（turnaround time，TAT）。由于早产儿身体器官发育尚未完善，在肠内营养支持治疗条件下体重容易快速变化，从而导致药物动力学的变化；另外早产儿出生后会长时间住在 NICU，呼吸系统疾病、感染等病情隐匿性强且变化快，而一般血药浓度检测时间为3 h，因此快速的血药浓度报告对于缩短判断周期，即时调整用药方案十分重要。

近年来，全自动二维高效液相色谱法（automatic 2-dimensional high performance liquid chromatography，2D-HPLC）逐渐应用到血药浓度监测[8-10]，本研究旨在研究氟康唑2D-HPLC 的各种条件，建立高灵敏度方法，降低血液样品体积需求，提高自动化，为早产儿氟康唑个体化用药提供适宜的监测技术，为临床医师用药提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

2D-LC-UV 系统由FLC 全自动二维液相色谱耦合仪（湖南德米特仪器有限公司）及岛津LC-20A 液相色谱部件构成，FLC 连接第一维色谱泵、第二维色谱泵、检测器、自动进样器等色谱模块；其中第一维色谱系统（LC1）完成样品富集及一维分离，第二维色谱系统（LC2）完成进一步分离检测，两维系统通过智能流路控制系统（TRS）连接，采用“中心切割”模式转移目标物，中间转移柱同时承担转移、拦截杂质的功能，工作站为Lab Solution 工作站，具体结构示意图见图1。GH-202 电子分析天平（AND，日本）；XW-80A 漩涡震荡仪（上海琪特）。

图1 全自动二维液相色谱工作原理示意图Fig 1 Schematic diagram for automatic 2D-HPLC

1.2 试药

氟康唑对照品（批号：100314-201204，含量：99.8%，中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈（色谱纯，ACS）；磷酸、磷酸铵、三氟乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；纯净水为纯水仪所制（不低于GB17323 执行标准）。

2 方法

2.1 色谱条件

第一维色谱柱采用Aston SNX1（氰基柱，3.5 mm×50 mm，5 μm，ANAX），流动相：V甲醇∶V水＝64∶36，流速0.8 mL·min－1。第二维色谱柱采用Aston SBN（苯基柱，4.6 mm×250 mm，5 μm，ANAX），流动相：V水∶V甲醇∶V乙腈＝54∶38∶8，流速1.0 mL·min－1；中间柱采用Aston SH4（苯基柱，4.6 mm×10 mm，3.5 μm，ANAX），辅助流动相为纯水，检测波长为209 nm，进样体积为200 μL。检测流程如表1所示。

表1 二维液相色谱条件设置-时间程序Tab 1 Time program for conditions in 2D-HPLC

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的配制 准确称取氟康唑对照品66.02 mg，用纯水溶解后，定容至50 mL，配制成质量浓度为1320.36 μg·mL－1的氟康唑对照品储备液。精密吸取不同量氟康唑对照品储备液，加入10 mL 量瓶中，用空白血浆定容至刻度，得到质量浓度为54.08、135.20、338.01、845.03、2640.71、5281.42 ng·mL－1的系列线性溶液，保存在－20℃待用。

2.2.2 质控样品配制 精密吸取“2.2.1”项下氟康唑对照品储备液适量，加入到10 mL 量瓶中，用空白血浆定容至刻度，配制成高、中、低3 种质量浓度（4225.13、2112.57、211.26 ng·mL－1），取3 mL 分装到质控瓶中，保存在－20℃冰箱中。

2.3 血浆样品处理

准确吸取10%三氟乙酸去蛋白剂 600 μL 至1.5 mL EP 管中，再准确加入 200 μL 血浆样本，涡旋振荡1 min 后，高速离心（14 500 r·min－1）8 min，取650 μL 上层清液转移至进样瓶中，加入1 mol·L－1的碳酸铵水溶液65 μL 调节pH 值，涡旋混匀。

3 结果

3.1 系统适用性试验

取空白血浆（中南大学湘雅二医院提供）、患者血浆样品处理溶液及氟康唑对照品溶液按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见图2。氟康唑保留时间为11.7 min，目标物从第一维转移到第二维色谱系统，需要约3 min 的样品处理时间。氟康唑与杂质分离较好，血浆内源性物质及其他杂质均不干扰样品的分离测定。大多数样品中均发现存在与氟康唑较为接近的色谱峰（见图2C），是否为代谢物有待继续研究。

图2 系统适用性试验色谱图Fig 2 System suitability chromatogram

3.2 线性范围和定量限

取“2.2.1”项下系列线性溶液，按“2.1”项下方法检测。以氟康唑的峰面积（Y）对氟康唑质量浓度（X，ng·mL－1）进行线性回归，得回归方程为：Y＝498.5X－3297.3，r＝0.9999，氟康唑在54.08～5281.42 ng·mL－1与峰面积呈良好的线性关系，定量限为54.08 ng·mL－1，能够满足临床新生儿氟康唑血药浓度检测要求。

3.3 准确度和精密度

取“2.2.2”项下质控样品进行方法学准确度和精密度检测。每个浓度梯度设置5 个平行组，计算实际浓度，比较实际浓度与理论浓度得出方法回收率和变异系数，检验方法准确度和日内精密度。连续3 d 用相同方法配制并测定质控样品，考察检测方法日间精密度。建立的氟康唑分析的方法回收率在93.6%～102.7%，RSD＜4.7%，日内、日间变异系数均小于5%。表明本法符合临床血药浓度监测检测的方法学要求。

3.4 提取回收率

取质量浓度为10 μg·mL－1的氟康唑对照品溶液（临用新配），用流动相稀释10 倍后作为对照，用空白血浆稀释10 倍，用同样的前处理方式沉淀样品，计算提取回收率。结果提取回收率为100.6%，RSD为4.6%（n＝6），证明本法的提取回收率高且稳定。

3.5 稳定性试验

取“2.2.2”项下的质控样品，分别于室温放置24 h、反复冻融 3 次以及－20℃冰冻保存30 d 后测定样品浓度，结果RSD均小于5%，表明血浆中氟康唑稳定性良好。

3.6 临床应用

2018年1月—2019年1月，本 院NICU 对40 名住院患儿预防性地给予口服氟康唑3 mg/（kg·次），每3日给药一次，直至治愈出院。根据氟康唑药代动力学特征，患儿在第3 次给药时达到稳态血药浓度，于第3 次给药后，对所有患儿通过足底毛细血管采样，共收集120 个血液样本，2 mL 抗凝管全血采集后经 3000 r·min－1离心 10 min，取上清液，－70℃冻存待检。冻存样本化冻后，按“2.3”项下方法处理样品后，按“2.1”项下方法测定，每位患者测3 个血清样本，随行测定高、中、低质控样品。平均采样量为（647±12.3）μL。其中81 个样本血药浓度介于200～2000 ng·mL－1，占总样本量的67%；28个样本结果介于2000～4000 ng·mL－1，占总样本量的23%；11 个样本结果高于4000 ng·mL－1，占总样本量的10%。

4 讨论

4.1 光谱图

氟康唑的3D 光谱图显示（见图3），氟康唑在206 nm 及261 nm 有最大吸收波长，261 nm 吸收强度远小于206 nm。209 nm 虽然不是最大吸收波长，但可以明显减小色谱图基线的波动，考虑到209 nm 与206 nm 相差并不大，因此选择209 nm 波长作为检测波长。由于氟康唑在波长222 nm 处吸收出现下降，引起色谱图基线较大的波动，所以应当使用参比较正，但使用参比校正时发现209 nm 波长差减222 nm 波长强度，虽然改善色谱图基线状态，但并未有效改善色谱图基线状态，因此未采用此技术。

图3 氟康唑3D 图Fig 3 3D stereogram of fluconazole

4.2 样品在线处理能力

本研究应用的全自动二维液相色谱系统，通过在线萃取提高测定灵敏度，但一维色谱柱通常载样量具有一定上限，因此进样量过大的时候，会发生柱上扩散现象。本文提出“进样量线性区间（linear injection volume，LIV）”表达二维系统在线萃取的能力，进样量增加至200 μL 时，峰面积增加开始不成线性，400 μL 与500 μL 二维系统产生的峰面积并没有太大差别，因此本方法设定进样量为200 μL，与普通色谱20 μL 比较，灵敏度可以提高10 倍。

4.3 长光程样品池与灵敏度

本系统应用近年出现的长光程紫外样品池提高检测灵敏度，与普通样品池比较，紫外线通过全息反射到达传感器端，光程长达85 mm，而普通样品池仅有10 mm 光程，根据朗伯比尔定律，光程越长灵敏度更高。但为了不增加样品池体积，长光程管道体积很小，容易发生堵塞，因此使用时需要特别注意，每次用完后清洗色谱柱和替换流动相中间的盐。

图4显示空白血样添加10 μg·mL－1氟康唑的两种样品池检测色谱图，长光程样品池获得峰面积约为标准样品池的6.5 倍，很大程度地提高了样品的测定能力。

图4 长光程样品池与标准样品池的灵敏度Fig 4 Sensitivity of long path sample cells and standard sample cells

氟康唑血药浓度测定受到基质效应、多电荷现象与源内裂解的限制[11-12]，内标修正上述技术缺陷，难以做到不同处理批使用同一校准曲线计算样品结果，尤其当不同条件测定方法交替、批数量过多、离子源劣化时，需要重新处理校准曲线，这样不仅需要更多的维护，也不具备足够的稳健性达到及时性要求；与HPLC 比较，紫外检测氟康唑灵敏度较低，需要复杂且耗时的前处理过程[13]。本方法开发的在线萃取、二维分离、长光程紫外检测以及光谱差减技术具有样品处理简单、分离过程自动以及检测稳定的特征，可达到早产儿血药浓度监测血样量需求小、报告及时的技术要求。

本研究分析并控制每个过程产生的时间消耗，通常早产儿足跟采血比成人静脉采血时间长，但也很少超过5 min；临床样品送达实验室时间与每个单位具体路线和程序有关，本院通常时间小于30 min；关键的时间消耗在实验室测定过程中产生，本研究采用新型2D-HPLC，利用稳定的光学检测系统，样品浓缩与分离自动完成，并标定了二维方法的转移特征，因此受环境温度变化、试剂纯度变化、样品复杂度变化影响小。本方法工作曲线可以长期使用，同时无需内标相关操作及每批定标操作，节省大量时间，可以在30 min 完成从测定系统启动到结果生成的过程。

目前，新生儿基于PK/PD 数据预防性使用氟康唑的经验十分有限。研究认为，氟康唑的稳态血药浓度应维持在2 mg·L－1以上，才能达到AUC/MIC为50 的临床预防效果[3]。笔者分析发现新生儿使用3 mg·kg－1，每周两次的给药方案后，仅33%的患儿氟康唑血药浓度在2 mg·L－1以上，结果提示氟康唑整体用药剂量不足，达到有效治疗浓度者不足1/3。因此，临床医师应可根据治疗药物监测结果，更密切地参与氟康唑临床用药，减少常规的经验用药和间接判断所致的不合理用药，减少不良反应，辅助精准医疗，降低住院费用，提升社会经济效益。