丙氨瑞林的合成

李宜航

(常德职业技术学院，湖南 常德 415000)

丙氨瑞林为一种人工合成的促性腺激素释放激素(GnRH)的九肽类似物，主要应用于治疗子宫内膜异位症。临床研究表明[1]该药用药初期可刺激垂体释放促卵泡素(FSH) 和促黄体生成素(LH)，引起卵巢源性甾体激素短暂升高；重复用药可抑制垂体释放LH和FSH，使血中的雌二醇水平下降，达到药物去卵巢的作用，这种抑制作用可用于治疗子宫内膜异位症等激素依赖性疾病。丙氨瑞林具有较高的药用价值和应用市场。

图1 丙氨瑞林合成路线Fig.1 Synthetic route of alarelin

目前丙氨瑞林的制备方法主要是以哌啶为脱帽试剂的多肽固相合成法[2]，主要存在制备方法成本相对较高，并且不方便运输和储存的缺点。本研究采用以哌嗪作为脱帽试剂用CTC树脂合成片段，结合液相法合成丙氨瑞林，哌嗪不是易制毒试剂，成本比经典合成法用的易制毒试剂哌啶要低，并且更方便运输和储存，此外，CTC树脂合成片段还以方便自动化生产[3-4]；CTC树脂可以回收重复利用；适合大规模工业化生产，没有剧烈的化学反应；降低了生产成本。合成工艺流程如下图所示：

1 仪器与试剂

Agilent technologies 1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Milli--Q超纯水系统，德国默克密理博公司；R-100型旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；GL-150干式恒温器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；旋涡混合器 XW-80A，上海精科实业有限公司。

2-氯三苯甲基氯树脂(CTC树脂，替代度为1.0 mmol·g-1)，天津南开合成科技有限公司；所有氨基酸均采购自吉尔生化(上海)有限公司；O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、二异丙基乙胺(DIEA)均采购自苏州昊帆生物股份有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)、二乙胺、石油醚均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 Leu-CTC 树脂的制备

称取25 g(25 mmol)CTC树脂于250 mL固相合成反应器中，取8.835 g(25 mmol)Fmoc-Leu-OH于250 mL三角瓶中，100 mL量筒量取DCM 120 mL，摇匀，加DIEA 41 mL(250 mmol)，摇匀溶解，倒入反应器开始反应。反应1 h时，用抽滤装置抽去反应液，用DMF洗4次；量取200 mL脱帽试剂5%哌嗪-DMF溶液，倒入反应器中，反应20 min，然后抽去反应液，DMF洗涤4次，抽干。洗脱完成后，取少许树脂，滴入茚三酮试液，并用干式加热器105 ℃加热约3 min，检验溶液呈蓝黑色。

2.2 Boc-Pglu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-树脂的合成

得到Leu-树脂后，向反应体系中添加第二氨基酸保护单体Fmoc-D-Ala-OH 15.567 g(50 mmol)、缩合剂HBTU 18.962 g(50 mmol)和碱DIEA 9.916 mL(60 mmol)，溶剂为DMF，反应时间为2小时，反应完成后，用DMF洗涤4遍，抽干。洗脱完成后，取少许树脂，滴入茚三酮试液，并用干式加热器105 ℃加热约3 min，检验溶液呈无色，既反应完全。得到Fmoc-D-Ala-Leu-树脂后，量取200 mL脱帽试剂5%哌嗪-DMF溶液，倒入反应器中，反应20 min，抽去反应液，DMF洗涤4次，抽干。洗脱完成后，取少许树脂，滴入茚三酮试液，并用干式加热器105 ℃加热约3 min，检验溶液呈蓝黑色，既获得D-Ala-Leu-树脂。在获得D-Ala-Leu-树脂后，按照上述缩合反应方法，依次在D-Ala-Leu-树脂上连接氨基酸保护单体：Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OHFmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-His(Boc)-OH和Boc-Pglu-OH后得到：Boc-Pglu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-树脂。

2.3 Boc-pGlu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-OH(化合物1)的制备

通过“2.2”项下制备出目标产物后，将“2.2”项下产物用DMF洗涤4次，异丙醇洗涤2次，抽极干。接着向反应体系里加入1%TFA/DCM溶液150 mL，摇摆反应10 min，收集反应液，重复6次，浓缩反应液，加10%柠檬酸溶液，析出白色固体，过滤，水洗至中性，真空干燥。得到化合物129.8 g，纯度为91.9%，收率为91%。RP-HPLC图见图2；其裂解的无保护样品ESI-MS图见图3。

图2 化合物1的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of compound 1

图3 化合物1 ESI-MS分析图谱Fig.3 ESI-MS analysis spectrum of compound 1

2.4 合成H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt(化合物2)

2.4.1 H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt·HCl的合成

称Fmoc-Arg(Pbf)-OH，100 mmol，65 g，BOP 110 mmol，49 g溶于500 mL DMF中，冷浴10 min，加入TEA 110 mmol，12 g。然后称取H-Pro-NHEt.HCl，110 mmol，20 g，用100 mL DMF+12 g TEA溶解，倒入上述反应液，反应2 h，HPLC显示反应完全，加入0.5 M盐酸析出，过滤，得白色固体产物，真空干燥，得产物87.4 g，其收率为108%，纯度为96.8%。RP-HPLC图见图4。

图4 化合物H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt·HCl的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of compound H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt·HCl

2.4.2 合成H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt(化合物2)

将“2.3.1”项产物用二乙胺500 mL溶解，搅拌30 min，HPLC显示反应完全。浓缩除去二乙胺，加石油醚析出，得到白色固体H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt，真空干燥，得产物51 g，其收率为92.6%，纯度为97.5%。RP-HPLC图见图5,ESI-MS图见图5。

图5 化合物2的HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of compound 2

2.4.3 H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt(化合物2)的的ESI-MS分析

对化合物2进行ESI-MS分析，可知化合物2[M+1]+峰为M/Z为552.1，与理论值550.9一致。见图6。

图6 化合物2 ESI-MS分析图谱Fig.6 ESI-MS analysis spectrum of compound 2

2.5 丙氨瑞林粗品的合成

2.5.1 丙氨瑞林前体的合成(化合物3)

取第一中间体(化合物1)10 mmol，13 g和BOP 11 mmol，4.9 g溶于20 mL DMF，-5 ℃冷浴10 min，另取第二中间体(化合物2)12 mmol，6.6 g，溶于20 mL THF中，反应2 h，HPLC检测反应完全。过滤除去白色固体，浓缩，加入0.5 M盐酸溶液，析出类白色固体，过滤，水洗至中性。真空干燥，得产物丙氨瑞林前体(化合物3)15.8 g，其产率为86.3%，纯度为91%。RP-HPLC图见图7。

图7 化合物3的HPLC色谱图Fig.7 HPLC chromatogram of compound 3

2.5.2 丙氨瑞林粗品的合成

取100 mL圆底烧瓶，称丙氨瑞林前体(化合物3)5 mmol(9.2 g)投入，加入切肽试剂(TFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5)切割，得到含有丙氨瑞林粗品的TFA溶液。浓缩TFA溶液至少量，加入乙醚。离心，真空干燥得丙氨瑞林粗品5.3 g，其纯度为91%，收率为83%。RP-HPLC图见图8，MS图见附图9。

图8 丙氨瑞林粗品的HPLC色谱图Fig.8 HPLC chromatogram of crude alarelin

图9 丙氨瑞林粗品ESI-MS分析图谱Fig.9 ESI-MS analysis spectrum of crude alarelin

2.6 树脂回收

将树脂用DMF洗涤三次，甲醇洗涤三次，抽去滤液，真空干燥。另配置二氯亚砜的DCM溶液，加入装有树脂的固相合成反应器中，反应2 h后，抽去反应液，DCM洗涤。

3 结 论

丙氨瑞林作为临床使用药物，现阶段对其药理活性研究较多，其合成研究相对较少。目前，在现有技术中，申请号为CN201710851059.5提供一种丙氨瑞林的固相制备方法[5]，该制备方法采用全固相合成的方式，反应简单可控，但因肽链较长，固相合成后期可能副产物较多，此外，现有技术多采用哌啶作为脱帽试剂，该试剂为易制毒管制试剂，采购及运输较为困难。本研究采用固液组合合成方式，前七个氨基酸(Boc-pGlu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-OH)采用固相合成方式，反应简单，纯度为91.9%，收率为91%，最后两个氨基酸(H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt)及丙氨瑞林粗品均采用液相合成的方式，降低了生产成本，减少了副产物的生产。

本研究利用多肽固相及液相合成结合法成功合成了丙氨瑞林，该方法操作简单，CTC树脂合成片段可以方便自动化生产且成本较低，纯度高，反应条件温和，适合大规模工业化生产。