杜鹃兰酮的合成及其脂质体制备研究*

谭李玉，陈 卓

(西安医学院，陕西 西安 710021)

高异黄酮(homoisoflavonoids)是一种特殊的黄酮类化合物，目前在自然界发现的高异黄酮非常少，仅有110余种[1]。高异黄酮是由色原酮或色满酮与苄基组成的，因此其结构中比异黄酮类化合物增加了一个碳原子。

杜鹃兰酮(Cremastranone，结构见图1)是一种天然高异黄酮，是从我国常见的药用植物杜鹃兰Cremastra appendiculata中分离得到的[2]。

图1 杜鹃兰酮的结构式Fig.1 The structure of cremastranone

药理学研究发现，杜鹃兰酮具有独特的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受体抑制作用，尤其对微血管具有较强的选择性抑制作用[3]。因此，杜鹃兰酮是一种潜在的抗湿性视网膜病变药物，在动物实验中观察到其抗视网膜新生血管作用显著，但对眼部大血管没有明显副作用[4]。

然而，杜鹃兰酮的眼用制剂制备过程中，其水溶性较差，给药后在结膜囊内滞留时间较短。因此，如何改善其水溶性，提高其生物利用度成为研究重点。脂质体具有由膜状脂质形成的微观双层囊泡结构，能够包合水溶性较差的药物，提高其水溶性，并产生缓释效果[5]。

杜鹃兰酮是二甲基取代的高异黄酮类化合物，其母核上的五个羟基中仅有两个被甲基取代[1]。目前，国内对高异黄酮的合成[6]及脂质体制备研究较少，本研究对其合成方法进行考察，并对其脂质体制备工艺进行了摸索。

图2 杜鹃兰酮的合成路线Fig.2 The preparation route of cremastranone

1 仪器与试剂

日本东京理化株式会社磁力搅拌低温槽PSL-1810型；Agilent TM 1260 型高效液相色谱仪。

4',3-二苄氧基-2',3',4-三甲氧基-6'-羟基二氢查尔酮为本课题组自制[6]；N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛的纯度为97%(Macklin Inc.)；钯碳：10%Pd(安耐吉化学)；胆固醇、大豆磷脂(安耐吉化学)；三甲基碘硅烷(97%,含铜作稳定剂，Macklin Inc.)；柱层析所使用薄层硅胶为硅胶H(青岛海洋化工);其他常见有机溶剂、试剂均为分析纯，必要时干燥。

2 杜鹃兰酮的制备研究

2.1 5,6,4'-三甲氧基-7,3'-羟基二氢高异黄酮(二甲基杜鹃兰酮)的合成

称量0.5 g(4 mmol)N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛，投入100 mL耐压厚壁圆底烧瓶中，加入4',3-二苄氧基-2',3',4-三甲氧基-6'-羟基二氢查尔酮1.06 g(2 mmol)。加入50 mL无水甲苯为溶剂。搅拌下加热，随温度提高反应物逐渐溶解，加热至回流后继续反应6 h。

薄层色谱法监控成环反应结束后，停止加热。冷却后向体系加入钯碳0.5 g，密闭加压静止1 h以检漏。而后以空气-氮气-氢气的顺序置换反应瓶内气体氛围，通过减压阀维持瓶内压为约1 atm。

室温反应3 h后回收钯碳，滤饼用30 mL甲苯分多次洗涤，滤液浓缩至干。所得红棕色胶状物以硅胶柱层析法(环己烷：乙酸乙酯1:1)纯化，得到产物黄色油状物411 mg，薄层色谱法鉴定为二甲基杜鹃兰酮，产率57.0%。

2.2 杜鹃兰酮的合成

将216 mg二甲基杜鹃兰酮(0.6 mmol)加入50 mL圆底烧瓶中，加入氯仿15 mL，室温下搅拌溶解后，将此反应装置置于-10 ℃磁力搅拌低温槽中。将碘代三甲硅烷 270 mg(1.35 mmol)的10 mL氯仿溶液置于恒压滴液漏斗中，在搅拌下滴入反应液中。滴毕-10℃持续搅拌30min，将反应装置移至室温下继续反应1.5 h，薄层色谱法监控反应，待反应结束后，将反应液倒入50 mL甲醇中。减压蒸馏，剩余物以50 mL氯仿溶解后，分别用亚硫酸氢钠水溶液、饱和碳酸氢钠溶液及饱和食盐水洗涤，干燥，蒸干。所得黑色油状物以硅胶柱层析法(环己烷:乙酸乙酯2:1至1:1)纯化，得到产物褐色固体132.1 mg，产率63.7%。经核磁共振波谱法验证为目标产物杜鹃兰酮,1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ 7.02 (d,J=5.8 Hz,1H), 6.91 (s,1H), 6.63 (m, 1H), 5.81 (s, 1H), 4.45 (dd,J=7.6,2.8 Hz,1H), 4.10 (dd,J=7.6,4.8 Hz,1H), 4.02 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.14 (dd,J=9.2,3.2 Hz, 1H), 2.70 (m, 2H)。

3 杜鹃兰酮脂质体制备方法的摸索

3.1 杜鹃兰酮脂质体的制备

将杜鹃兰酮10 mg、胆固醇、大豆磷脂加入250 mL茄形瓶中，以适量无水乙醇溶清，用旋转蒸发仪减压回收乙醇，期间保持蒸馏温度不高于40 ℃。

蒸干后，在茄形瓶壁上得到均匀薄膜，呈淡黄色，如成膜不均匀，则以无水乙醇溶解后重复。

向茄型瓶中加入5%葡萄糖缓冲液50 mL，连接旋转蒸发仪，在 40 ℃下缓慢旋转30 min。再超声分散30 min，得到淡黄色均匀的水溶液，再用0.45 μm微孔滤膜过滤即得杜鹃兰酮脂质体水溶液。

3.2 杜鹃兰酮脂质体的包封率测定方法

色谱条件：色谱柱为月旭 Ultimate LP-C18型 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇.4%磷酸(55:45)；检测波长：360 nm，流速 1 mL/min，进样量 10 μL。外标一点法定量。

离心法测定包封率：精密量取脂质体1 mL，加 入50 mL甲醇后超声5 min破乳，稀释10倍后采用上述色谱条件测得杜鹃兰酮总含量(W总)；精密量取脂质体1 mL，10000 r/min离心30 min，精密称量上清液10 mg于5 mL容量瓶中，甲醇定容后以上述色谱条件测得游离杜鹃兰酮量(W游)；包封率计算公式为：

包封率=[(W总-W游)/W总]×100%

3.3 杜鹃兰酮脂质体的制备工艺摸索

考察脂质用量时，本研究采用胆固醇与大豆磷脂质量比为1:8作为脂质，分别考察了不同脂质用量下的脂质体包封率，结果见表1。

表1 脂质用量对杜鹃兰酮脂质体包封率的影响Table 1 Effects on lipid dosage to the entrapment rate of liposome

考察脂质构成的影响时，我们采用34倍的脂质用量。考察结果如表2所示。

表2 脂质构成对杜鹃兰酮脂质体包封率的影响Table 2 Effects on lipid composition to the entrapment rate of liposome

4 结 论

本研究以较易于制备及储存的4',3-二苄氧基-2',3',4-三甲氧基-6'-羟基二氢查尔酮为原料，通过DMF-DMA关环，钯碳催化氢化脱苄基得到了二甲基杜鹃兰酮。以碘代三甲硅烷作为去甲基化试剂，在温和的条件下实现了杜鹃兰酮5位的选择性去甲基化。

为了摸索杜鹃兰酮眼用制剂的制备方法，以胆固醇、大豆磷脂为脂质，制备了杜鹃兰酮脂质体，提高了杜鹃兰酮的水溶性，改善了其稳定性和缓释性。摸索了杜鹃兰酮脂质体的制备工艺，初步确定胆固醇与大豆磷脂质量比为1:8，脂质用量为34:1时为包封率与载药量较协调的最佳工艺。