中和表位串联的PCV2b病毒样颗粒在昆虫细胞中的表达与鉴定

任春晓，冯 华，张 腾，3，蒋 敏，4，刘运超，金前跃，张改平

（1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州450002；3.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712000；4.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450001）

猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated disease，PCVAD）是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的一类疾病的总称，包括断奶仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综 合 征（PRDC）等[1-2]。PCV2分 为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f、PCV2g、PCV2h等8个亚型，其中，PCV2b是诱发PCVAD的主要PCV2基因亚型，感染猪在临床上通常出现厌食、发育迟缓、呼吸困难、精神沉郁、淋巴结肿大等症状，死亡率可达40%左右，给养猪业造成巨大的经济损失[3]。

PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，是一类单链无囊膜环状DNA病毒[4-5]。PCV2基因组长度在1 767～1 768 bp，包含11个开放阅读框（ORF1—11），其中，ORF1和ORF2是最主要的开放阅读框[6]。ORF1编码2个复制酶蛋白Rep（Rep′），ORF2编码PCV2唯一的结构蛋白Cap[7]。Cap蛋白包含了主要抗原中和表位，是PCV2主要的免疫蛋白[8]，且与PCV1的Cap蛋白没有抗原交叉反应，能够在体外自组装成病毒样颗粒（VLP）[9]，通常作为PCV2疫苗研制的首选蛋白。目前，已经在Cap蛋白上鉴定出多个抗原表位[10]，如77NDFLPPG831、69STIDYFQPNNKR180、195HVGLGTAF202、226LKDPPLNP233、138YDPYVNY144等。其 中，表位226LKDPPLNP233能有效地刺激机体产生免疫应答，在PCV2亚单位疫苗研制中提供了新的研究方向。

PCV2亚单位疫苗能够明显降低病毒血症的发生率,减轻PCV2感染对淋巴组织的损伤[11]，然而通过原核表达系统制备得到的蛋白质纯化过程较为复杂，纯化得率较低，且免疫原性差，蛋白质颗粒形态不够完善，而相比大肠杆菌表达系统，昆虫杆状病毒表达系统能够对外源蛋白进行糖基化、磷酸化等修饰，避免了外源蛋白在大肠杆菌中易形成包涵体的弊端，使重组蛋白具有与病毒天然蛋白相似的结构和活性，更有利于病毒样颗粒的形成[12]。因此，研制基于真核表达系统表达的重组蛋白亚单位疫苗，成为了开发PCV2疫苗的首选，进一步提高PCV2亚单位疫苗免疫原性及保护性成为疫苗研发中亟待解决的问题。研究表明，将中和表位连接在Cap蛋白的C端能有效诱导针对Cap蛋白与该中和表位的特异免疫反应[13]。鉴于此，构建C端重复串联中和表位226LKDPPLNP233的Cap蛋白，在昆虫杆状病毒表达系统中表达，并对其进行鉴定，纯化后进行动物免疫试验，评价其免疫原性，以期为研制高效新型的PCV2亚单位疫苗提供参考。

1 材料和方法

1.1 细胞、载体与主要试剂

DH5α感受态细胞、DH10Bac感受态细胞、sf21细胞及pFastBacTMⅠ载体均保存于河南省农业科学院动物免疫学重点实验室；DL2000 DNA Marker、Primer Max DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ均采购于TaKaRa公司；质粒提取试剂盒采购于OMEGA公司；彩虹180蛋白质Marker、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、ECL显色液试剂盒及AEC底物显色试剂盒均采购于Solarbio公司；PCV2抗体检测ELISA试剂盒采购于无锡优联生物科技有限公司；PCV2单克隆抗体、PCV2毒株、PCV2基因组DNA、HRP标记的羊抗鼠二抗保存于本实验室；PCV2亚单位疫苗采购于勃林格殷格翰公司。

1.2 目的基因的扩增与重组表达载体的构建

经过对河南株PCV2b（GenBank:AY969004.1）cap基因序列的分析，分别设计2对特异性引物cap-F和cap-R、cap-F和capE2-R（表1），对cap及其C端重复串联2个中和表位226LKDPPLNP233的嵌合cap（capE2）基因进行扩增。PCR程序：98℃预变性1 min；98℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸90 s，30个循环。利用T4 DNA连接酶分别将得到的cap和capE2基因构建至pFastBacTMⅠ载体的BamHⅠ和HindⅢ位点之间，分别转化DH5α感受态细胞后，挑选阳性菌落以相应引物对其进行PCR鉴定，获得重组质粒。再将重组质粒分别转化DH10Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选，将阳性重组菌送至上海生工生物工程有限公司进行测序鉴定，并将构建好的阳性重组质粒分别命名为pFastBacTMⅠ-cap、pFastBacTMⅠ-capE2。

表1 PCR扩增引物序列Tab.1 The primer sequences for PCR amplification

1.3 重组蛋白的表达、纯化与鉴定

将重组质粒pFastBacTMⅠ-cap、pFastBacTMⅠ-capE2分别转染生长状态良好的sf21细胞，培养至第3代，收集重组杆状病毒再次接入生长状况良好的sf21细胞，振荡培养72 h后，1 000 r/min离心15 min，收集细胞；以1×PBS溶液重悬细胞后，反复冻融破碎细胞，收集裂解液，对表达的重组蛋白Cap、CapE2进行初步SDS-PAGE鉴定。裂解液经10 000×g超速离心2 h使目的蛋白沉淀，将得到的蛋白质重悬液置于30%～60%的蔗糖溶液中，再次超速离心，用取样针缓慢吸取目的蛋白，通过SDS-PAGE、Western blot（PCV2单克隆抗体为一抗）进行鉴定并测定浓度。

1.4 PCV2b病毒样颗粒动态光散射鉴定及透射电镜观察

通过动态光散射及透射电镜对纯化得到的Cap、CapE2蛋白分别进行分析，以评估其水化半径和蛋白质结构。各取出适量纯化的重组蛋白，分别滴于碳膜铜网上，室温静置90 s，用滤纸缓缓吸去碳膜上的液体，晾置30 s后，以pH值为7.0、1%的磷钨酸染液染色1 min，用滤纸缓慢吸去膜上多余染液，避风干燥后于透射电镜下观察。

1.5 动物免疫试验及抗体效价测定

将采购于河南省实验动物中心的16只6～8周龄的Balb/c雌性小鼠随机分为4组，分别以10μg的Cap、CapE2对其进行皮下多点免疫，每间隔14 d免疫一次，共免疫3次，并设置勃林格殷格翰公司的PCV2亚单位商品疫苗作为阳性对照、PBS作为阴性对照；分别于首次免疫后14、28、42 d对实验动物进行断尾采血，将收集到的样品置于37℃静置2 h后离心分离血清。

利用江苏无锡优联PCV2抗体检测ELISA试剂盒检测所采集血清中的抗体效价，将待检血清40倍稀释后与阴、阳性对照分别加入酶标板中，与包被的抗原在37℃孵育30 min，每孔加入200μL洗涤液冲洗5次，甩干多余液体；每孔加入100μL酶标二抗，37℃静置30 min，弃去孔中液体，洗涤液冲洗5次，甩干多余液体；再加入试剂盒中显色液，避光显色10 min，随即加入终止液，并于酶标仪上以630 nm的波长对样品OD值进行读数。

1.6 血清中和抗体效价测定

第2次加强免疫后，收集血清样品进行中和试验。将待检血清进行2倍系列稀释，分别与200 TCID50的PCV2b病毒液等量均匀混合，并同时设置阳性血清和阴性血清为对照组，于37℃培养箱中孵育1 h后，将混合液缓慢加入提前铺有单层PK15细胞的96孔板中，在37℃培养箱中培养72 h后，于倒置显微镜下通过IPMA检测细胞染色情况。中和抗体效价通过计算完全抑制病毒感染的血清稀释倍数的倒数得到。

2 结果与分析

2.1 重组表达载体pFastBacTMⅠ-cap和pFastBacTMⅠ-capE2的鉴定

利用限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ将目的片段构建到pFastBacTMⅠ载体上，并转化到DH5α感受态细胞中，对获得的阳性重组菌进行PCR鉴定。琼脂糖凝胶电泳结果显示（图1），在预期目的片段大小处出现明显的条带，pFastBacTMⅠ-cap、pFastBacTMⅠ-capE2扩增条带大小分别为714、750 bp。将PCR鉴定为阳性的菌液送上海生工生物工程有限公司测序鉴定，结果与预期序列吻合。

图1 重组载体p FastBac TMⅠ-cap、p FastBac TMⅠ-capE2 PCR鉴定结果Fig.1 PCR identification results of recombinant vectors pFastBacTMⅠ-cap，p FastBac TMⅠ-capE2

2.2 重组蛋白Cap和Cap E2的表达、纯化及鉴定

将阳性重组质粒pFastBacTMⅠ-cap、pFastBacTMⅠ-capE2转染sf21细胞，传至第4代后，培养至72 h收集细胞，对sf21细胞表达的重组蛋白进行SDS-PAGE鉴定，结果显示，在28 ku处出现清晰明显的条带，与预期重组蛋白的大小一致，证明重组蛋白成功表达。裂解液进一步经蔗糖密度梯度离心纯化后，得到纯度较高的重组蛋白Cap、CapE2（图2）。

图2重组蛋白Cap、Cap E2的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysisof Cap，Cap E2 recombinant proteins

以PCV2单克隆抗体为一抗对目的蛋白分别进行Western blot鉴定，结果显示，目的蛋白在28 ku处均产生特异反应条带（图3），表明纯化后的蛋白质均能与PCV2单克隆抗体反应良好。

图3 重组蛋白Cap、Cap E2的Western blot鉴定Fig.3 Identification of Cap，Cap E2 recombinant proteins by Western blot

2.3 PCV2b VLP的形态鉴定

将附着有目的蛋白的铜网置透射电镜下观察，发现Cap、CapE2均形成了直径约17 nm的病毒样颗粒（图4）。动态光散射分析显示，目的蛋白Cap、CapE2均形成了颗粒状物质，直径分布在17 nm左右（图5）。

图4 重组蛋白Cap、Cap E2 VLP形态观察Fig.4 VLPmorphology of Cap and CapE2 recombinant proteins

图5 重组蛋白Cap、Cap E2动态光散射分析Fig.5 Dynamic light scattering analysis of Cap and Cap E2 recombinant proteins

2.4 重组蛋白Cap、Cap E2免疫血清ELISA抗体效价测定

分别以Cap、CapE2、阳性对照、阴性对照免疫小鼠后，收集免疫血清，以ELISA方法测定血清中的抗体水平。如图6所示，相比PBS组，其余免疫组在首免后均能刺激机体产生免疫应答反应，在2次加强免疫后抗体水平显著提高，并持续至3免后第14天。虽然第2次免疫重组蛋白后血清抗体水平略低于疫苗组，但目的蛋白（Cap、CapE2）组抗体水平在第3次免疫后均超过疫苗组，其中，CapE2抗体水平显著高于Cap（P＜0.05）和疫苗组（P＜0.01），并保持了较好的增长趋势。

图6 重组蛋白Cap、Cap E2免疫血清抗体效价检测Fig.6 Antibody detection of Cap and Cap E2 recombinant proteins immunized serums

2.5 重组蛋白Cap、Cap E2免疫血清中和抗体效价测定

对2次加强免疫后第14天采集的小鼠血清与PCV2病毒进行中和抗体效价测定，结果如图7所示。试验组均具有较高的中和效价；而Cap组（P＜0.01）与CapE2组（P＜0.01）血清中的PCV2中和抗体水平均显著优于疫苗组，CapE2组血清中和效价高达1∶29。

图7重组蛋白Cap、Cap E2免疫血清中和抗体测定Fig.7 Neutralizing antibody determination of Cap and Cap E2 recombinant proteins immunized serums

3 结论与讨论

PCV2是引起PCVAD的主要病原体，在临床上通常导致病猪生长缓慢、呼吸困难、日渐消瘦等症状，病情严重可导致死亡，给养猪业带来了巨大的经济损失[14]。目前，针对PCV2的防控手段主要是疫苗接种，在市场上灭活苗和亚单位疫苗占据了主导地位[15]，但灭活苗成本相对较高，并且可能因灭活不完全存在潜在毒性的威胁[16]，亚单位疫苗相比灭活苗而言，有着安全高效、节约成本、产生的免疫刺激显著等优点[17]。研究表明，PCV2 Cap蛋白连接自身或外源中和表位均能有效地刺激机体发生特异性免疫应答，产生针对Cap蛋白的抗体[10]。本研究成功表达了带有自身中和表位的嵌合Cap蛋白，能够与PCV2单克隆抗体发生特异反应，体外形成病毒样颗粒并能够有效激活体液免疫。

目前，大多数商用PCV2亚单位疫苗将重组Cap蛋白表达在昆虫杆状病毒表达系统。在昆虫细胞内表达的病毒结构蛋白可以自组装成VLP，采用蔗糖密度梯度离心的方法纯化后的VLP不含哺乳动物细胞组分，安全性好，因此该系统广泛用于构建VLP[18]。本研究将中和表位226LKDPPLNP233重复串联于PCV2 Cap蛋白C端，利用真核表达系统以杆状病毒为载体在昆虫细胞内表达目的蛋白Cap、CapE2。经SDS-PAGE鉴定，Cap、CapE2重组蛋白在28 ku处均有明显条带出现。Western blot鉴定分析，Cap、CapE2重组蛋白经纯化后在28 ku处均能与PCV2单克隆抗体产生特异性反应，证明所得到的目的蛋白均具有良好的免疫原性。

相比大肠杆菌表达系统，昆虫杆状病毒表达系统能够对外源蛋白进行糖基化、磷酸化等修饰[19]，避免了重组蛋白在大肠杆菌中易形成包涵体的弊端，使重组蛋白具有与病毒天然蛋白相似的结构和活性，更有利于VLP的的形成[20]。本研究中，动态光散射和透射电镜分析结果表明，目的蛋白Cap、CapE2均形成了直径在17 nm左右的病毒样颗粒，证明连接自身中和表位对Cap形成VLP并无明显影响。此外，与在大肠杆菌表达系统[21]中得到的PCV2 VLP相比，本研究得到的VLP形态更完整，大小更均一。

病毒样颗粒无病毒核酸，不能自主复制，却具有与病毒相同的形态。因此，在保证安全性的同时，可通过与病毒相同的途径刺激机体产生免疫应答，结构完善的病毒样颗粒更能有效地激发机体产生体液免疫和细胞免疫[22]。将纯化后的重组蛋白进行免疫试验。前2次免疫后，CapE2组的免疫效果均优于Cap组，在第3次加强免疫后，CapE2组抗体水平显著高于Cap和疫苗免疫对照组，并有持续增长的趋势，证明免疫CapE2蛋白后能够激发更长的免疫保护期。血清抗体检测结果表明，Cap、CapE2蛋白均能刺激机体产生免疫应答，而相比原核表达的Cap蛋白[23]，本研究表达的Cap蛋白更为有效，这可能与真核系统表达出的蛋白质形成了具有良好结构的病毒样颗粒有关。中和试验结果进一步证明，相比商业疫苗，Cap、CapE2蛋白更能够有效刺激中和抗体产生。

综上，本研究通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了重复连接226LKDPPLNP233中和表位的重组Cap蛋白，该蛋白质自组装形成病毒样颗粒，并在动物试验中具有较好的免疫反应，且完全中和PCV2病毒的血清抗体稀释倍数高达29，对PCV2亚单位疫苗的研制具有重要意义。