灯盏细辛多酚纯化工艺的响应面法优化及其抑菌活性研究

牛鹤丽

（白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000）

多酚是一类含有羟基和苯环的弱极性化合物，包括类黄酮、酚酸、单宁、二苯乙烯等，对人体的健康与营养平衡具有重要影响[1-2]，国内外对其进行大量研究，发现植物多酚具有较好的抗氧化、抗炎及抑菌功效[3-5]。

灯盏细辛(Erigeron breviscapus)属于菊科多年生草本植物，富含黄酮类、多酚类、咖啡酸酯类等活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂及增强机体免疫等活性[6-7]。目前国内外对于灯盏细辛的研究主要集中在其有效成分提取和相关生物学活性评价等方面，如：Yang 等[8]从灯盏细辛分离出的葡萄糖基转移酶可高效合成相应酰基-葡萄糖酯或糖苷；朱静静等[9]采用超声辅助提取灯盏细辛中多酚化合物，并体外评价其抗氧化活性；Zhu 等[10]发现黄芩素可抑制NLRP3 炎性体介导的炎症反应。多酚作为灯盏细辛的主要活性成分之一，其抑菌活性研究目前鲜有提及，而其提取物中仍含有鞣质等杂质[9]，可能影响其活性功效。为此，本研究利用大孔树脂具有机械筛分与化学吸附的特点，纯化灯盏细辛多酚提取物，探讨不同工艺条件对产物中多酚化合物回收率的影响，同时考察纯化后的多酚化合物对不同受试菌的抑菌活性，从而为灯盏细辛的后续开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

灯盏细辛采购于白城市吉林大药房，经白城医学高等专科学校刘大伟老师鉴定为菊科多年生草本植物灯盏细辛。

没食子酸标准品，成都埃法生物科技有限公司；无水碳酸钠，国药集团化学试剂有限公司；福林酚试剂，上海康朗生物科技有限公司；AB-8、DM 130 型大孔树脂，天津浩聚树脂科技有限公司；H103、X-5 型大孔树脂，沧州宝恩吸附材料科技有限公司；HPD-600、NKA-II 大孔树脂，天津西金纳环保材料科技有限公司；琼脂粉、蛋白胨、牛肉膏，北京奥博星生物技术有限公司；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌，吉林北方微生物研究所；灭菌注射用水，华润双鹤药业股份有限公司；牛肉膏蛋白胨固体培养基，自制；青霉素钠，山东鲁抗医药股份有限公司；试验用水为超纯水。

1.1.2 仪器与设备

TU-19 型紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；ME204 型电子天平，梅特勒-特利多公司；RE-52AA 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；TG18G-II 型台式高速离心机，盐城凯特实验仪器有限公司；COS-211B 型恒温振荡器，上海利闻科学仪器有限公司；FC-10AE 型冷冻干燥机，河北国辉实验仪器有限公司；JC-150-SE 型恒温恒湿培养箱，青岛精诚仪器仪表有限公司；数控超声波器，上海坤诚科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物制备

灯盏细辛完全粉碎后，过80 目筛，准确称取10.00 g 灯盏细辛粉末，加入体积为300 mL 的1%盐酸-乙醇混合溶液(体积比为2∶98)，于200 W、50 ℃提取50 min 后离心，吸取上清液于35 ℃下浓缩，冷冻干燥（冷阱温度：-45 ℃，真空度0.020 kPa）后，即得多酚提取物[9]，纯化时以水为溶剂，配制成不同浓度的上样液。

1.2.2 多酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteau 法[11]测定不同样品的多酚含量，具体操作如下：采用体积分数为70%乙醇溶解样品后，移取1 mL 加入2.5 mL 福林酚试剂，充分振摇后，加入7 mL 饱和碳酸钠溶液后，以试剂空白作参比，于765 nm 测定吸光度值。配制不同浓度的没食子酸标准溶液，绘制标准曲线回归方程为：y=4.212x+0.021（r=0.999 5），表明在0.05～0.2 mg/mL 的多酚浓度范围下线性关系良好。另将纯化后的洗脱液减压蒸发，浓缩干燥后称重，根据下式计算纯化产物的多酚纯度。

1.2.3 不同树脂的静态吸附-洗脱性能比较

准确称取2.0 g 经预处理后的不同型号树脂[12]，置于50 mL 2.0 mg/mL 多酚提取液中，于30 ℃振荡吸附24 h 至树脂饱和吸附后过滤，过滤后的树脂经纯化水清洗后置于锥形瓶内，加入100 mL 体积分数为70%的乙醇，于30 ℃振荡解吸24 h，测定上清液中多酚含量，根据下式测得不同型号树脂对多酚化合物的吸附率、洗脱率及回收率[13-14]。

式中：ce为饱和吸附后滤液中多酚的质量浓度，mg/mL；c0为提取液中多酚的质量浓度，mg/mL；cd为洗脱液中多酚的质量浓度，mg/mL；V0为提取液体积，mL；Vd为洗脱液体积，mL；Qe为饱和吸附率，%；Dd为洗脱率，%；R 为回收率，%。

1.2.4 动态吸附-解吸条件优化

1.2.4.1 动态吸附条件考察

以吸附率为考察指标，采用湿法将20 mL 活化的H103 型树脂装入层析柱（径高比为1∶5）内，分别研究不同上样液质量浓度、上样液pH 及上样流速对吸附率的影响，具体如下：①当上样液pH 为5.0、体积为80 mL，上样流速为2 mL/min 时，上样液质量浓度分别为：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL；②当上样液质量浓度为2.0 mg/mL，上样流速为2 mL/min，上样液体积为80 mL 时，上样液pH 分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；③当上样液质量浓度为2.0 mg/mL，上样液pH 为5.0 时，绘制上样流速分别为1、2、3 mL/min 的树脂泄漏曲线。

1.2.4.2 动态洗脱条件考察

以洗脱率为考察指标，分别研究不同洗脱液乙醇的体积分数及洗脱流速的影响，具体如下：①当洗脱流速为1 mL/min，乙醇体积分数分别为：50%、60%、70%、80%、90%；②当乙醇体积分数为70%时，绘制洗脱流速分别为1、2、3 mL/min 的洗脱曲线。

1.2.5 响应面试验设计

在单因素试验基础上，固定上样液体积80 mL、上样流速2 mL/min、洗脱流速1 mL/min、洗脱液体积120 mL，以上样液质量浓度（A）、上样液pH（B）和乙醇体积分数（C）为响应因素，回收率为响应值（Y），设计响应面试验，确定最佳纯化工艺条件，试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.6 抑菌活性试验

1.2.6.1 菌种活化与样品配制

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌接种于培养基上，于37 ℃培养24 h 后，制得105CFU/mL菌悬液，吸取20 mL 涂布于平板中，晾干[15]。将纯化后的灯盏细辛多酚使用无菌水溶解后，配制成10.0 mg/mL多酚溶液，同时配制10.0 mg/mL 青霉素钠溶液作为阳性对照[16]。

1.2.6.2 抑菌活性测定

采用滤纸片法考察纯化后的灯盏细辛多酚的抑菌活性[17]，具体如下：将直径6 mm 的灭菌圆纸片分别浸泡于相同浓度的多酚与青霉素钠溶液中2 h 后，贴于布满菌液的培养基平板中，于37 ℃培养24 h，检测抑菌圈直径，每个受试菌平行检测3 次，另以无菌水作阴性对照。

1.2.7 数据处理

每组试验平行测定3 次，试验结果采用平均值±标准差表示，并采用SPSS 19.0 进行方差分析，检验水准α=0.05，当P＜0.05 表示具有显著性差异，P＜0.01表示具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂选择

由于不同类型大孔树脂的表面性质、多孔结构及形成氢键的能力不同，因而对目标化合物具有不同的吸附能力，分别考察6 种型号树脂对灯盏细辛多酚的吸附性能，结果见表2。从表2 可知，H103 树脂的吸附率最高，达到85.7%，且静态吸附-解吸后，目标化合物的回收率最高，达到71.2%，这归因于所有树脂的粒径相近，而该树脂的比表面积较大，因此对多酚化合物的吸附量较多，同时其结构中未有功能性基团，且孔表面疏水性较强，因而与多酚中芳烃疏水结构之间的作用力较弱，易于洗脱[18]，因此确定采用H103 树脂作为吸附剂，进一步研究其对灯盏细辛多酚的分离纯化效果。

表2 大孔吸附树脂静态吸附性能Table 2 Static adsorption properties of macroporous resins

2.2 动态吸附试验结果

2.2.1 上样液质量浓度对吸附率的影响

上样液质量浓度对灯盏细辛多酚吸附率的影响见图1。从图1 可知，当上样液质量浓度为1.0～2.0 mg/mL时，吸附率无显著性差异，但随着上样液质量浓度增大至2.0 mg/mL 后，吸附率开始下降。这可能归因于上样液质量浓度过大，容易造成树脂被部分杂质堵塞，使得吸附率降低[19]，但当上样液质量浓度低于2.0 mg/mL 时，树脂的使用效率较低。因此以上样液质量浓度1.5、2.0、2.5 mg/mL 作为后续响应面试验因素考察水平。

2) 启动联锁。当主机停机、主机控制模块采集到任一启动联锁故障信号时发生启动联锁，主机不允许启动并发出启动联锁报警，当且仅当故障排除或通过复位清除故障报警时才可启动主机。

图1 上样液质量浓度对吸附率的影响Fig.1 Effects of sample concentrations on adsorption rates

2.2.2 上样液pH 对吸附率的影响

上样液pH 对灯盏细辛多酚吸附率的影响见图2。从图2 可知，随着上样液pH 的增大，吸附率呈先增大后减小的趋势，当上样液pH 为5.0 时，吸附率达到最大，这是由于随着上样液pH 的变化，目标化合物在溶液中的存在形式发生改变，进而影响其与树脂的分子间作用。灯盏细辛多酚存在大量的酚羟基，呈弱酸性，在弱酸性溶液中易以分子形式存在，从而有利于树脂的吸附[20]。因此以上样液pH 4.0、5.0、6.0 作为响应面试验因素考察水平。

图2 上样液pH 对吸附率的影响Fig.2 Effects of pH values of sample solution on adsorption rates

2.2.3 不同流速的树脂泄漏曲线

当流出液中目标化合物的浓度约为上样液多酚质量浓度的1/10 时，则被认为达到泄漏点[21]，此时吸附过程最佳，为此分别考察不同流速下树脂动态吸附的泄漏曲线，结果见图3。随着上样流速的增大，树脂的泄漏点对应的上样液体积逐渐提前，这归因于多酚化合物在树脂内的吸附依赖于扩散，若流速过快，其与树脂表面接触不充分，因而未有效扩散吸附，便被冲出柱外，但流速过慢又导致吸附时间过长。综合考虑吸附效率，确定最佳上样流速为2 mL/min，上样体积为80 mL。

图3 不同上样流速的树脂泄漏曲线Fig.3 The leakage curves of H103 resin in different flow velocities

2.3 动态洗脱试验结果

2.3.1 乙醇体积分数对洗脱率的影响

图4 为不同体积分数的乙醇溶液对灯盏细辛多酚洗脱率的影响。随着乙醇体积分数的增大，洗脱率逐渐升高，随后缓慢下降。这归因于不同体积分数的乙醇溶液极性不同，当体积分数过高时，部分醇溶性杂质易从树脂解吸脱附，而体积分数过低时，吸附在树脂内的多酚又较难溶出。因此以乙醇体积分数60%、70%、80%作为响应面试验因素考察水平。

图4 乙醇体积分数对洗脱率的影响Fig.4 The effects of eluent concentrations on desorption rates

2.3.2 不同流速的洗脱曲线

图5 为不同洗脱流速时饱和吸附后树脂的洗脱曲线。从图5 可知，洗脱流速越快，洗脱曲线峰形越宽、拖尾越明显，且乙醇消耗量增多，而采用体积分数为70%乙醇溶液以1 mL/min 流速洗脱时，洗脱曲线的峰型集中、对称且无明显拖尾，洗脱效果较好。因此确定最佳洗脱流速为1.0 mL/min，洗脱液用量120 mL。

图5 不同流速的洗脱曲线Fig.5 The dynamic desorption curves in different flow velocities

2.4 响应面试验结果及分析

2.4.1 响应面试验结果

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken 中心组合设计原理，进行三因素三水平的RSM 分析试验，分别考察上样液质量浓度（A）、上样液pH（B）和乙醇体积分数（C）对多酚化合物回收率（Y）的影响，结果见表3。

表3 响应面试验结果Table 3 Results of the response surface experiment

2.4.2 响应面方差分析

采用多元回归拟合上述试验结果，得到回收率对各因素的二次多元回归方程：Y=66.94-0.075A+0.013B-0.11C-0.45AB-0.20AC-0.37BC-3.21A2-2.28B2-1.23C2，对其进行显著性检验与方差分析，结果见表4。

表4 回归方程的显著性检验及方差分析结果Table 4 The results of significance testing and variance analysis of regression equation

从表4 可知，该回归模型P=0.000 2＜0.01，表明试验选择的二次多项模型回归效果显著，可反映实际结果，R2=0.969 0 表明模型可充分拟合试验数据，同时失拟项P=0.592 1＞0.05 表明该回归方程拟合度较高，误差对试验结果影响较小。在所有作用因素中，仅二次项A2、B2、C2对多酚的回收率影响极显著（P＜0.01）。从表中F 值可知，各因素的影响顺序为：乙醇体积分数（C）＞上样液质量浓度（A）＞上样液pH（B）。

2.4.3 两因素间的交互作用

图6 为各因素的交互作用对多酚化合物回收率的影响，响应曲面越陡峭，表明该因素对回收率的影响越大[22]，而响应曲面越平滑，则交互作用对回收率的影响不显著。从图6 可知，各因素的交互作用均不显著，曲面较平滑，随着上样液质量浓度、上样液pH和乙醇体积分数的增大，回收率逐渐升高，并出现极大值，随后呈不同斜率的下降。

图6 各因素之间的交互作用对回收率影响的响应曲面图Fig.6 Response surface diagrams showing the interaction effects of various factors

2.5 验证试验

通过对二次抛物线函数模型进行极值分析，确定H103 树脂纯化灯盏细辛多酚的最佳工艺条件为：体积为80 mL，质量浓度为1.9 mg/mL，pH 为5.1 的灯盏细辛多酚提取液以2 mL/min 流速上样后，经体积分数为69%乙醇溶液，以1 mL/min 流速洗脱，对灯盏细辛多酚的理论回收率为67.9%，实际回收率为68.5%，与模型预测值较接近，表明该二次多项回归模型可预测各因素与响应值间的影响关系。刘祖望等[23]曾采用AB-8 型大孔树脂纯化刺梨多酚，产物纯度约为纯化前的4.9 倍。张卉等[24]采用XAD-7 型大孔树脂纯化黑果腺肋花楸多酚，产物纯度约为纯化前的7.8 倍。在本试验工艺条件下，产物中多酚的纯度由11.25%提高至54.76%，约为纯化前的4.9 倍，表明该工艺分离纯化效果较高，适于灯盏细辛多酚提取物的纯化。

2.6 纯化后的灯盏细辛多酚抑菌活性

纯化后的灯盏细辛多酚对不同细菌的抑菌效果见表5。该多酚化合物对3 种细菌均有一定的抑制作用，其中抑制金黄色葡萄球菌的生长最为明显，抑菌圈直径达到（14.19±1.14）mm，这与李柯欣[25]研究茶多酚对不同受试菌的抑制作用结果一致，而阳性对照采用的青霉素钠则对3 种细菌均有较强的抑制作用，特别是对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到（15.79±1.33）mm。两种物质对大肠杆菌的抑制有极显著性差异（P＜0.01），而对枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制有显著性差异（P＜0.05）。

表5 不同样品的抑菌圈直径(n=3)Table 5 Inhibition zone diameters of different materials(n=3)单位：mm

3 结论

随着对天然产物生物活性研究的不断深入，大量多糖类、黄酮类、皂苷类等化合物被发现抑菌活性较好，为此本研究探讨了大孔树脂纯化灯盏细辛多酚的最佳工艺条件并分析其抑菌活性。结果表明，体积为80 mL，质量浓度为1.9 mg/mL，pH 为5.1 的灯盏细辛多酚提取液以2 mL/min 流速上样后，经体积分数为69%乙醇溶液，以1 mL/min 流速洗脱，对灯盏细辛多酚的理论回收率为67.9%，实际回收率为68.5%。抑菌活性试验显示，纯化后的灯盏细辛多酚对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，特别是对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，因此可为相关天然产物的后续开发与利用提供参考依据。