独活寄生汤高效液相色谱指纹图谱的建立和7种有效成分含量的测定

吴洪杰 林蕾 滕莉

摘要 目的：建立高效液相色譜（HPLC）指纹图谱法分析独活寄生汤中7种有效成分的方法，为临床独活寄生汤中药处方的质量控制提供参考依据。方法：分析独活寄生汤中药处方现代药理研究文献，筛选HPLC检测主要有效成分，建立HPLC检测上述有效成分的色谱条件，考察精密度、重复性、加样回收率，检测5批次独活寄生汤煎液中独参汤中蛇床子素、二氢欧山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、芍药苷、松脂醇二葡萄糖苷、β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0含量。HPLC检测独活寄生汤中主要有效成分的色谱条件为：ODSC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析柱;1 mL/min;柱温为30 ℃，进样量10 μL，检测方法：设置监测波长0～40 min采用330 nm检测，41～80 min采用230 nm检测;流动相：乙腈-0.08%甲酸（A），水-2.5%异丙醇-0.08%甲酸（B）洗脱程序：0～25 min，10%～26%流动相A，26～30 min，27%～44%流动相A，31～35 min，45%～46%流动相A，41～45 min，47%～48%流动相A;46～65 min，49%～92%流动相A;66～80 min，93%～100%流动相A。结果：蛇床子素、二氢欧山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、芍药苷、松脂醇二葡萄糖苷、β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0具有较好的线性关系，精密度（日内和日间）RSD值均低于2.5%，7种成分检测重复性RSD值均低于3.5%，7种成分的加样回收率均≥95.0%。5批次独活寄生汤中7种成分含量比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：独活寄生汤主要有效成分可通过HPLC进行定量分析，但不同种含量差异较大，可能与煎药人不同、中药材批次不同有关。

关键词 独活寄生汤;高效液相色谱指纹图谱法;芍药苷;蛇床子素;二氢欧山芹醇-β-D葡萄糖苷;β-蜕皮甾酮;人参皂苷R0;方法学研究

Establishment of HPLC Fingerprint and Determination of 7 Components in Duhuo Jisheng Decoction

WU Hongjie， LIN Lei， TENG Li

（Pharmacy Department， Yantaishan Hospital of Yantai， Shandong Province， Yantai 264000， China）

Abstract Objective：To establish a HPLC fingerprint method for the analysis of 7 effective components in Duhuo Jisheng decoction， so as to provide reference for the quality control of Chinese medicinal prescription in Duhuo Jisheng Decoction. Methods：The modern pharmacological research literature of Duhuo Jisheng Decoction was analyzed， the main effective components were screened by HPLC， the chromatographic conditions were established for the determination of the above effective components by HPLC， and the precision， repeatability and sample recovery were investigated. The osthol， dihydrocarvacrol-β-D glucoside， dihydrocarvacrol， paeoniflorin and pinoresinol， β-ecdysterone， ginsenoside R0 in 5 batches of Duhuo Jisheng Decoction were detected. The chromatographic conditions for the determination of the main active ingredients in Duhuojisheng Decoction by HPLC were：odsc18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μ m）; 1 mL/min; column temperature was 30 ℃， injection volume was 10 μ L; detection method：the detection wavelength was set at 330 nm for 0～40 min and 230 nm for 41～80 min; mobile phase：acetonitrile-0.08% formic acid （a）， water-2.5% isopropanol-0.08% formic acid （B） Sequence：0～25 min， 10%～26% mobile phase A， 26～30 min， 27%～44% mobile phase A， 31～35 min， 45%～46% mobile phase A， 41～45 min， 47%～48% mobile phase A; 46～65 min， 49%～92% mobile phase A （2）. For 66 to 80 min， 93% to 100% mobile phase A. Results：There was a good linear relationship between osthol， dihydrocarinol-β-D glucoside， dihydrocarinol， paeoniflorin， rosinol diglucoside， β-ecdysterone and ginsenoside R0. The RSDS of precision （intra-day and inter-day） were all lower than 2.5%， and the repeatability RSDS of the 7 components were all lower than 3.5%. The recoveries of 7 components were all ≥95.0%. There were statistically significant differences in the content of 7 ingredients in weight of 5 batches of Duhuo Jisheng Decoction （P<0.05）. Conclusion：the main effective components of Duhuo Jisheng Decoction can be quantitatively analyzed by HPLC， but the contents of different kinds of drugs are quite different， which may be related to different decocting people and different batches of Chinese medicinal.

Keywords Duhuojisheng Decoction; HPLC fingerprint; Paeoniflorin; Osthol; Dihydrocresol-β-D glucoside; β-ecdysterone; Ginsenoside R0; Methodological study

中图分类号：R289.4;R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.013

独活寄生汤始见于《备急千金要方》，對其功效描述为：“治腰背痛，独活寄生汤。夫腰背痛者，皆犹肾气虚弱，卧冷湿地当风所得也，不时速治，喜流入脚膝，为偏枯冷痹缓弱疼重，或腰痛挛脚重痹，宜急服此方。”[1-3]经后世医家完善方剂及用法，以治疗肾气虚弱、肝脾不足而致的关节病为主。《医方考》《灵枢经》中均有独活寄生汤治疗关节病的病机及治则描述[4]。本研究拟建立独活寄生汤高效液相色谱指纹图谱质量控制方法，以期为临床独活寄生汤古方新用等临床研究工作提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪采用安捷伦公司生产的型号为1290 Infinity LC的高效液相色谱仪及其配高的经验泵、检测器、自动进样泵、柱温箱。常规试验仪器如电子分析天平、水浴锅、冰箱、蒸发仪等为本院实验室仪器设备。色谱柱为ODS公司生产的C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析柱。

1.2 试剂 色谱级乙腈、甲醇购自德国Merck公司，AR级甲酸、异丙醇购自四川鸿鹤化工试剂有限公司。所用水为医院仪器分析实验室自制新鲜重蒸馏水。

1.3 分析样品 从中国生物制品检定所购买蛇床子素、二氢欧山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、芍药苷、松脂醇二葡萄糖苷、β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0对照品。本研究所用中药材均为本医院中药房提供，汤剂均由本院制剂室煎制。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱（HPLC） 检测独活寄生汤种有效成分色谱条件筛选：HPLC检测独活寄生汤中主要有效成分的色谱条件为：ODSC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析柱;1 mL/min;柱温为30 ℃，进样量10 μL，检测方法：设置监测波长0～40 min采用330 nm检测，41～80 min采用230 nm检测;流动相：乙腈-0.08%甲酸（A），水-2.5%异丙醇-0.08%甲酸（B）洗脱程序：0～25 min，10%～26%流动相A，26～30 min，27%～44%流动相A，31～35 min，45%～46%流动相A，41～45 min，47%～48%流动相A;46～65 min，49%～92%流动相A;66～80 min，93%～100%流动相A。

2.2 对照品溶液配制 采用十万级电子天平精密称取蛇床子素、二氢欧山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、芍药苷、松脂醇二葡萄糖苷、β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0对照品于25 mL棕色容量瓶中，加蒸馏水约20 mL，手动振摇后置于常温的超声振荡器中震荡溶解10 min，取出再补加蒸馏水至25 mL刻度，具塞摇匀即为对照品溶液。分别取6份对照品母液，制作不同浓度水平的对照组液。对照溶液于4 ℃冰箱中保存，用前取出摇匀。

2.3 供试品溶液制备 按照独活寄生汤的处方配齐中药材，粉碎过筛，干燥。精密称取混匀粉末0.5 g于索氏提取器中，加入25 mL蒸馏水，于水浴锅上加热至沸腾，回流提取120 min，经快速滤纸过滤，用蒸馏水多次少量洗涤滤渣，补水至25 mL，混匀，离心得上层清液，再采用微孔滤膜过滤得供试品溶液。按照7种有效成分的色谱条件检测，进样量10 μL，检测时间80 min。

2.4 专属性试验 对制备的5批样品溶液进行检测，主成分间、主成分与杂质之间分离度均大于1.0，说明该色谱条件检测独活寄生汤专属性强。

2.5 线性关系考察 取蛇床子素、二氢欧山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、芍药苷、松脂醇二葡萄糖苷、β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0对照品溶液，采用流动相（A∶B=1∶1）分别稀释成1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍溶液摇匀，制成对照品系列浓度溶液，分别进样10 μL，按照确定的色谱条件进行分离检测。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制各对照品的回归方程。各成分检测限及回归方程见表1。

2.6 日间精密度试验 分别对7种对照溶液进行日内精密度测试：同一日内，同一个瓶对照品溶液，每间隔4 h进样检测1次，连续进样6次，对6次检测结果计算均值、标准差，计算6次样品检测结果的标准偏差值（RSD）。7种有效成分的精密度（日内和日间）RSD值均低于2.5%。见表2。

2.7 供试品溶液稳定性试验 连续3 d在同一个时间段，分别取上述对照品溶液每日检测2次，HPLC按照检查前基线平衡，检测结束后走基线至平稳的方式操作。对照品溶液存放于4 ℃冰箱保存，用时取出。计算6次检测结果均值，计算日间RSD值。计算6次检测结果均值，计算日间RSD值。7种有效成分的精密度（日内和日间）RSD值均低于2.5%。见表3。

2.8 重复性试验 取独活寄生汤处方中药材，按照处方中剂量分别称取6份，按照2.3项下方法制备供试品溶液共6份，分别进样检测，计算7种有效成分的含量均值及相对标准偏差，7种成分检测重复性RSD值均低于3.5%。见表4。

2.9 回收率试验 取1分独活寄生汤中药材，向药材中加入与处方中各成分浓度相近的对照品溶液，按照2.3项下方法制备供试品溶液，进样检测，计算7种有效成分的加样回收率，7种成分的加样回收率均≥95.0%。见表5。

2.10 样品测定结果 由医院药房按照独活寄生汤处方：独活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防风、川芎、人参、甘草、当归、芍药、干地黄各6 g，为1剂，加水300 mL煮沸后文火微沸煎汤至200 mL，密封装袋，连续煎5剂，于当天检测，参照2.3项下的稀释方法配制成供试品溶液，进样检测7种有效成分的含量，7种成分含量比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表6。

3 讨论

独活寄生汤是临床治疗痹症的经典处方[5]，全方以辛温之品独活、桑寄生、细辛、防风、秦艽、桂枝为君，主升举肝脾之气，治腰膝酸痛;辅以养阴活血之品熟地黄、当归、白芍、川芎、杜仲、牛膝等，助滋补肝肾之阴，行血理气之功;再予以益气之品人参、茯苓、甘草达养诸脏之阳祛冷痹之力[6-7]。随着医药技术的发展，现在已有药厂在独活寄生汤处方上生产了独活寄生合剂、独活寄生颗粒剂等，采用独活寄生汤治疗慢性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性坐骨神经痛、腰肌劳损、骨质增生症、小儿麻痹等属风寒湿痹日久，正气不足等[8-9]。临床研究显示[10-11]，其作用独特，应用范围广。目前临床应用的独活寄生颗粒剂和合剂在有效成分的控制方面，以芍药苷为主。现代中药药理研究显示，独活发挥治疗疗效的有效成分以蛇床子素、二氢欧山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氢欧山芹醇为主，杜仲的有效成分以松脂醇二葡萄糖苷为主，牛膝发挥治疗作用的有效成分以β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0为主[12-13]。通过分析上述7种成分的化学性质及极性，具备采用高效液相色谱指纹图谱法制定定量控制质量标准的条件。

高效液相色谱指纹图谱作为控制中药材、中成药的重要手段[14]，其不仅可以通过高效液相色谱图的图像相似率情况对处方中的药材进行定性鉴别，还可通过分离检测有效成分的含量对其进行质量状况进行评价[15-16]。本研究采用高效液相色谱指纹图谱对独活寄生汤中7种有效成分进行检测，结果显示，所确定的色谱条件可对7种有效成分实行有效分离和检测，方法学各项指标均符合高效液相色谱检测的標准范围[17-18]。但对5个批次的独活寄生汤煎液进行7种成分检测，每个批次成分含量差异均较大。说明煎药方法对药效成分的影响较大。这提示对于临床广泛应用的经典中药组方，应考虑制成稳定的剂型，以稳定质量，确保疗效[19]。

综上所述，独活寄生汤主要很有效成分可通过高效液相色谱法进行定量分析，但不同种含量差异较大，可能与煎药人不同、中药材批次不同有关，临床应加强对独活寄生汤中药材的筛选及对煎药方法进行规范，提高汤药的质量稳定性。

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（2020-04-01收稿 责任编辑：张雄杰）

基金项目：山东省医药卫生科技发展计划立项项目（Y2016HW038）

作者简介：吴洪杰（1980.11—），女，硕士，主管中药师，研究方向：中药学，E-mail：wanxiayu@yeah.net