结核分枝杆菌相关γ-干扰素检测联合结核杆菌DNA、结核抗体检测对菌阴肺结核阳性检出率的影响

胡月红

[摘要]目的研究結核分枝杆菌相关γ-干扰素（TB-IGRA）检测联合结核杆菌脱氧核糖核酸（TB- DNA）、结核抗体（TB-Ab）检测菌阴肺结核患者对阳性检出率的影响。方法选取2019年3月至2020年3月厦门大学附属第一医院菌阴肺结核疑似患者158例，均行 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 检测，以组织培养及病理检查为“金标准”，统计 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 单一检测、两两结合、三者联合检测菌阴肺结核阳性的诊断结果，并比较诊断效能（灵敏度、特异度、准确度）。结果 TB-IGRA 检测肺结核真阳性81例，真阴性31例;TB-DNA 检测真阳性60例，真阴性36例;TB-Ab 检测真阳性73例，真阴性30例;TB-IGRA + TB-DNA 检测真阳性91例，真阴性27例;TB-IGRA + TB-Ab 检测真阳性87例，真阴性29例;TB-DNA + TB-Ab 检测真阳性95例，真阴性28例;TB-IGRA、TB-DNA 及 TB-Ab 三者联合检测肺结核真阳性108例，真阴性25例;TB-IGRA 检测肺结核灵敏度略高于 TB-DNA、TB-Ab 检测（ P <0.05）;三者联合诊断的灵敏度、准确度高于两两联合诊断，而两两联合诊断的灵敏度、准确度高于 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 单一检测，差异有统计学意义（ P <0.05）。结论 TB-IGRA、TB-DNA、 TB-Ab 三种方法联合检测能提高菌阴肺结核患者诊断效能，有助于临床合理治疗方案的制订，具有良好应用价值。

[关键词]结核分枝杆菌相关γ-干扰素检测;结核杆菌 DNA 检测;结核抗体检测;菌阴肺结核;阳性检出率

[中图分类号] R521; R446.6  [文献标识码] A   [文章编号]2095-0616（2021）23-0146-05

Influence of Mycobacterium tuberculosis-related interferon-γ detection combined with Mycobacterium tuberculosis DNA and tuberculosis antibody detection on positive detection rate of bacterial negative pulmonary tuberculosis

HU  Yuehong

The First Affiliated Hospital of Xiamen University， Fujian， Xiamen 361003， China

[Abstract] Objective To study the influence of Mycobacterium tuberculosis-related interferon-γ（TB-IGRA） detection combined with Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid （TB-DNA） and Tuberculosis antibody （TB-Ab） detection on the positive detection rate of patients with bacterial negative pulmonary tuberculosis （PTB）. Methods A total of 158 suspected patients with bacterial negative PTB in the First Affiliated Hospital of Xiamen University from March 2019 to March 2020 were selected and they were detected for TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab. Taking tissue culture and pathological examination as the "gold standard"， the diagnostic results of single detection， pairwise detection and combined detection of TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab were counted， and the diagnostic efficiency （sensitivity， specificity and accuracy） were compared. Results TB-IGRA detection showed that 81 cases were true positive and 31 cases were true negative. TB-DNA detection informed us of true positive in 60 cases and true negative in 36 cases. TB-Ab detection demonstrated that 73 cases was true positive and 30 cases was true negative. TB-IGRA + TB-DNA detection showed positive in 91 cases and negative in 27 cases. TB-IGRA + TB-Ab detection showed true positive in 87 cases and true negative in 29 cases. TB-DNA + TB-Ab showed true positive in 95 cases and true negative in 28 cases. TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab were combined to detect 108 cases of true positive and 25 cases of true negative PTB. TB-IGRA was slightly more sensitive than TB-DNA and TB-Ab （P <0.05）. The sensitivity and accuracy of the combined diagnosis of the three methods were higher than those of the combined diagnosis of pairwise detection， while the sensitivity and accuracy of the combined diagnosis of pairwise detectionwere higher than those of TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab alone， with statistically significant differences （P <0.05）. Conclusion The combined detection of TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab can improve the diagnostic efficiency of patients with bacterial negative PTB， and contribute to the formulation of rational clinical treatment plan， which has good application value.

[Key words] Detection of Mycobacterium tuberculosis related interferon-γ; Tuberculosis DNA detection; Tuberculosis antibody detection; bacterial negative pulmonary tuberculosis; Positive detection rate

肺结核是临床常见慢性传染疾病，在全球范围内特别是发展中国家具有较高发病率，我国结核病新发患者近88.9万，发病率为63/10万，临床诊治关键是早期准确诊断与隔离治疗[1]。而对于三次痰涂片与一次培养均为阴性的菌阴肺结核临床诊断难度较大，极易出现误诊漏诊情况，因此寻求更准确方法以快速早期诊断结核病对其防治效果具有重要意义[2]。实验室检测指标对肺结核诊断具有重要意义，其中结核分枝杆菌相关γ-干扰素（TB- IGRA）是通过检测受结核分枝杆菌特异性抗原刺激而活化的效应 T 细胞来诊断结核感染，可用于结核分枝杆菌活动感染或潜伏感染的辅助诊断[3]。通过聚合酶链式反应（PCR）测定结核杆菌脱氧核糖核酸（TB-DNA）能直接判断结核杆菌诊断效果[4];而结核抗体（TB-Ab）是通过检测血清中 IgG 或 IgM 抗体间接反映结核杆菌阳性情况。本研究选取厦门大学附属第一医院菌阴肺结核疑似患者158例，旨在探讨 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 联合检测的价值。现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

经我院医学伦理委员会批准，选取2019年3月至2020年3月我院菌阴肺结核疑似患者158例，其中男82例，女76例;年龄21～74岁，平均（49.68±12.01）岁;体质量指数（BMI）18.2～25.4 kg/m2，平均（22.43±1.19）kg/m2。

1.2纳入及排除标准

纳入标准：均符合《肺结核基层诊疗指南（2018年）》中相关诊断标准[5];均伴有咳嗽咳痰、全身疲乏、体重下降等临床表现;均接受 X 线胸部摄片，存在团块状阴影;精神或意识清晰可配合正常检查治疗;均签署知情同意书。排除标准：合并其他呼吸系统疾病;凝血功能障碍;合并恶性肿瘤、传染性疾病;既往接受过抗结核药物治疗;合并严重心肝肾等重要脏器功能障碍。

1.3方法

1.3.1 TB-IGRA 检测采用静脉穿刺术采集全血标本4 ml，颠倒混匀后分装到“N”“T”“P”三种培养管中，1 ml/管，并于37℃培养（22±2）h，然后以3000 r/min 的速度离心10 min，取血浆进行酶联免疫吸附法检测;定量检测 IFN-γ，将浓缩洗涤液用蒸馏水进行20倍稀释，充分溶解后得到400 pg/ml 的校准品，然后进行稀释，最终得到的校准品浓度分别为400、200、100、50、25、12.5 pg/ml;将样品对应微孔按序编号，每个受试者的3种培养血浆各1孔，校准品各双孔，空白对照1孔;分别在相应孔中加入20μl 样品稀释液（除空白对照孔）;分别在相应孔中加入50μl 待测样品或校准品（除空白对照孔），震荡混匀，用封板膜封板后，置37℃下温育60 min;然后每孔加入50μl 酶标试剂（除空白对照孔），轻轻震荡混匀，封板后置37℃下温育60 min，揭掉封板膜采用洗板机洗涤5遍;然后每孔各加入50μl 显色剂 A、B 液，振荡混匀，于37℃避光显色15 min;每孔加50μl 终止液，振荡混匀，10 min 内采用酶标仪波长于450 nm 处检测，并用空白孔调零点后测定各孔 A 值。阳性结果判定标准[6]：N 值≤400、P-N 为任何值、T-N ≥14并且≥ N/4时为阳性，提示患者感染结核分枝杆菌。

1.3.2 TB-DNA 检测采用厦门致善生物科技股份有限公司提供的仪器，并严格按照操作步骤进行，将痰处理液或4%氢氧化钠以痰液体积的1～2倍加入痰液中，观察痰液黏稠程度，并混合震荡，30 min 消化至水样;取1 ml 樣本于1.5 ml 离心管中，并在管盖上进行标记;以13000 r/min 的速度离心5 min 后，弃去上清液，再取1 ml 样本置于1.5 ml 离心管中，重复0～2次后富集步骤可观察到沉淀物，取500μl TB-DNA 提取液至1.5 ml 离心管，然后将沉淀物混匀重悬;离心管置于金属干热仪上，设置99℃灭活10 min;准备试剂条，在左边第1孔中加入20μl 增强液及预处理样本，并在第10孔右沿空白处标记编号，仪器运行结束后，取左边起第10孔为纯化 DNA 溶液，置入离心管中，标记编号备用;然后以13000 r/min 的速度离心5 min，若观察到沉淀物则取上清，转移至新的1.5 ml 离心管中再保存。

1.3.3 TB-Ab 检测①采用胶体金法测定结核分枝杆菌的 IgG 抗体，首先在反应孔内加入1滴缓冲液，完全渗入后加入150μl 待测血清，然后加入金标液3滴，最后加洗涤液3滴，于3 min 内观测结果。若 T 区出现红色印迹则为 IgG 抗体阳性，T 区未出现红色印迹为 IgG 抗体阴性。②采用酶联免疫吸附法（ELISA）法测定结核分枝杆菌的 IgM 抗体，分别加入稀释液100μl、标本5μl，于37℃下温浴10 min，洗板5次后加入酶结合物50μl，经温浴、洗板后加入显色剂，采用酶标仪比色，若 OD 值≥0.2则为 IgM 抗体阳性，OD 值<0.2则为 IgM 抗体阴性。阳性结果判定标准[7]：结核分枝杆菌 IgG 与 IgM 抗体其中一项为阳性则为 TB-Ab 阳性，否则为阴性。

1.3.4组织培养及病理检查所有患者给予局部麻醉，在胸部 CT 引导下进行经皮穿刺，采集肺部病灶组织活检;采用福尔马林固定活检样本，将 NALA 溶解组织与病理组织样本加入7H9肉汤中，充分碾碎后倒入试管内，加入2% NALC-NaOH 溶液，强力震荡20 s后，加入50 ml磷酸缓冲液（PBS），以3000 r/min 的速度离心15 min 后，弃去上层液后加入2 ml PBS，接种至培养皿内进行组织培养，培养6周后能分离出结核杆菌者即为阳性，否则为阴性。另外，采用包埋法处理石蜡切片，经光学显微镜观察抗酸杆菌，其中经染色后，细胞质和细胞核为蓝色，抗酸杆菌为红色，若观察到抗酸杆菌即为阳性。

1.3.5聯合诊断标准 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 两两结合检测与三者联合检测均以任一阳性均为阳性为标准[8]。

1.4观察指标

①比较 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 单一检测菌阴肺结核阳性的诊断结果;②比较 TB-IGRA、TB- DNA、TB-Ab 两两结合检测的诊断结果;③比较 TB- IGRA、TB-DNA、TB-Ab 三者联合检测的诊断结果;④比较 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 单一检测及联合检测的诊断效能：灵敏度、特异度、准确度。

1.5统计学方法

采用 SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析，计数资料以[n （%）]表示，行χ2检验，P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab单一检测结果

经组织培养及病理检查，158例菌阴肺结核疑似患者中阳性117例，阴性41例;TB-IGRA 检测肺结核真阳性81例，真阴性31例;TB-DNA 检测真阳性60例，真阴性36例;TB-Ab 检测真阳性73例，真阴性30例。见表1。

2.2 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab两两结合检测结果

TB-IGRA + TB-DNA检测肺结核真阳性91例，真阴性27例;TB-IGRA + TB-Ab检测真阳性87例，真阴性29例;TB-DNA + TB-Ab 检测真阳性95例，真阴性28例。见表2。

2.3 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab三者联合检测结果

TB-IGRA、TB-DNA 及 TB-Ab 三者联合检测肺结核真阳性108例，真阴性25例。见表3。

2.4单一检测及联合检测诊断效能

TB-IGRA 检测肺结核灵敏度略高于 TB-DNA、 TB-Ab 检测（ P <0.05）;三者联合诊断的灵敏度、准确度高于两两联合诊断，而两两联合诊断的灵敏度、准确度高于 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 单一检测，差异有统计学意义（ P <0.05）。见表4。

3讨论

肺结核是指由结核分枝杆菌引起、发生于肺组织、支气管、胸膜的结核疾病，传染性较强、传播范围极广，会严重威胁人类健康[9]。控制结核病的关键环节在于早发现、早诊断、早治疗，提高治愈率，减少肺结核的流行。

细菌学检查是目前临床最常用肺结核检测方法，同时也是确诊及治疗方案制订的重要依据[10];但由于肺结核患者痰液呈现间歇性排菌、结核菌自身生长速度较慢或痰标本质量不合格等多种因素影响，使痰分枝杆菌培养结果呈现阴性，导致部分肺结核患者无法确诊，增加传播风险[11]。因此，临床实践过程中，应配合有效实验室检查完善菌阴肺结核的诊断过程，对病情控制具有重要意义。随着检测技术的不断进步改善，TB-IGRA、TB-DNA、 TB-Ab 等多种更为快捷简单的检测在临床逐渐开展，且本研究中 TB-IGRA 检测肺结核灵敏度略高于 TB-DNA、TB-Ab 检测（ P <0.05），与龚清河[12]结果具有一致性。其中 TB-Ab 属于体液免疫检查技术，肺结核患者会产生结核杆菌免疫球蛋白， TB-Ab 通过免疫应答机制对机体抗结核免疫反应进行检测，据此诊断是否伴有结核杆菌的感染[13]。 TB-DNA 检测作为结核病诊断的新标准，具有较低误诊率，本研究中诊断肺结核特异度高达87.81%，是补充病原学诊断的最佳选择，但灵敏度仅有51.28%。而 TB-IGRA 属于细胞免疫检查技术，肺结核患者机体外周 T 淋巴细胞参与免疫应答，受到特异性抗原激活后，会转化为效应 T 淋巴细胞，分泌释放γ-干扰素[14];TB-IGRA 通过微孔条上预包被的 IFN-γ抗体可与样品中的 IFN-γ结合，再加入酶标试剂进行二次温育，当样品中存在 IFN-γ时，将形成“包被抗体-IFN-γ-酶标抗体”复合物，然后形成催化显色剂反应，据此诊断是否感染结核菌[15]。由于无论是否有结核病症状、免疫功能水平等均对 TB-IGRA 法结果影响较小，都能通过检测效应 T 细胞确定是否伴有结核分枝杆菌的感染，因此 TB-IGRA 法检测灵敏度略高。多种检测方法联合诊断为临床提高菌阴肺结核阳性检出率提供了新的研究方向[16]。基于此，本研究将 TB-IGRA、 TB-DNA、TB-Ab 三种方法联合应用，结果显示三者联合诊断灵敏度、准确度均高于单一检测或两两联合检测（ P <0.05），其中三者联合检测可将单个方法检测的灵敏度69.23%、51.28%、62.39%提高至92.31%，因此联合检测能明显提高诊断效能，减少菌阴肺结核的漏诊误诊，临床可推广应用。但本研究取样以单中心为主，且样本量较小，具有一定局限性，临床进一步研究中应扩大样本量，并尽量多中心取样，保证研究合理性与准确度;另外，临床可进一步结合其他诊断方法如结核菌纯蛋白衍生物试验、TST、HLA-G 等进一步提高对肺结核的诊断价值，为临床提供更加准确的诊断结果，协助临床治疗。

综上所述， TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 三种方法联合检测能提高菌阴肺结核患者诊断效能，有助于临床合理治疗方案的制订，具有良好应用价值。

[参考文献]

[1]蔡晓婷，杜雨华，钟静，等.2014—2018年广州市海珠区登记结核病患者流行病学特征分析[J].结核病与肺部健康杂志，2019，8（2）：100-105.

[2]Zhao Y，Xu M，Chen L，et al.Levels of TB-IGRA may help to differentiate between intestinal tuberculosis and Crohn's disease in patients with positive results[J].Therap Adv Gastroenterol，2020（13）：1756284820922003.

[3]宋健，鄧爱兵，李杨，等.不同支气管镜介导标本的 TB-DNA 检测对痰涂片阴性肺结核患者的诊断价值研究[J].中国医学装备，2019，16（5）：74-76.

[4]刘佳栋，汪宏良，朱杰稳，等.结核抗体、结核杆菌培养联合结核感染 T 细胞监测对肿瘤患者合并结核感染的指导意义[J].临床肺科杂志，2019，24（4）：592-595.

[5]中华医学会，中华医学会杂志社，中华医学会全科医学分会，等.肺结核基层诊疗指南（2018年）[J].中华全科医师杂志，2019，18（8）：709-717.

[6]王浩，徐叶红，郝建，等.TB-IGRA 对肺结核的诊断价值及假阴性影响因素探讨[J].临床肺科杂志，2018，23（7）：1190-1193.

[7]王晓莉，张伟林，赵贤武，等.多种无创检查对慢性阻塞性肺疾病并痰菌阴性肺结核的诊断价值[J].广东医学，2020，41（13）：1399-1401.

[8]代佳伟，张米，谢祺，等.3种检测方法在不同人群结核潜伏性感染诊断中的应用价值[J].检验医学与临床，2020，17（6）：809-811.

[9]李越，武俊平，吴琦，等.肺结核患者支气管肺泡灌洗液中致病菌的分布特征和影响因素[J].中国慢性病预防与控制，2020，28（5）：368-371.

[10]Ely KZ，Dotta RM，Jarczewski CA， et al.Bacteriological diagnosis of tuberculosis in prison inmates： Actions taken by the primary health care teams in prisons[J].J Bras Pneumol，2020，46（2）：e20190179.

[11]蒋骏，张晓龙，王斐娴，等.苏州市初治菌阴肺结核患者就诊延迟现况及临床特征[J].中国热带医学，2020，20（5）：439-442.

[12]龚清河.结核抗体检测联合结核菌纯蛋白衍生物试验辅助诊断肺结核的价值[J].实用医学杂志，2019，35（21）：3384-3388.

[13]彭丹，陈国强，童凯，等.血清 ADA、IL-27、 TB-Ab 联合检测诊断血性结核性胸腔积液的价值研究[J].中国现代医学杂志，2020，30（22）：91-94.

[14]钟剑峰，童涌，宋群，等.IGRA 与 TST 在肺结核痰菌阳性患者家庭密切接触者感染的诊断评价[J].中华医院感染学杂志，2018，28（11）：1629-1632.

[15]弓艳娥，郭旭霞，杨金华，等.TB-IGRA 联合 HLA-G 检测对结核分枝杆菌感染患者的诊断效果评价[J].中华医院感染学杂志，2018，28（21）：3215-3218.

[16]路超奇，张万江，陈创夫，等.T-SPOT 对痰涂片阳性患者与阴性患者的结核病诊断的准确性影响因素分析[J].农垦医学，2020，42（6）：489-495.

（收稿日期：2021-06-22）