HPLC法同时测定刺山柑果实正丁醇部位中3种成分及该部位抑菌活性

包晓玮， 赵文燕， 曾兰君， 魏晨业， 金渭荃

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆军区保障部药品仪器监督检验站，新疆 乌鲁木齐 830052)

刺山柑CapparisspinosaL.为白花菜科山柑属植物，属多年生藤本小半灌木[1]，其药用部位为叶、果实、根皮，性温，味辛、苦，具有祛风、通鼻窍、止淤消肿、止痛活血之功效，维吾尔族民间常将其果实捣碎后贴敷，用于治疗关节炎和肩周炎等疾病[2]。Khanfar[3]从刺山柑中分离得到2个新化合物，经质谱分析鉴定均为生物碱；Sharaf等[4]对3种山柑属植物中的黄酮进行分析，共发现23种，其中果实含槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-7-O-芸香糖苷等；Germanò等[5]从刺山柑地上部分中分离得到芦丁、异鼠李素-3-芸香苷。

研究表明，芦丁[6]、对羟基苯甲酸[7]、异槲皮苷[8]均具有良好的抗菌作用。因此，本实验在前期基础上[9-10]建立HPLC法同时测定刺山柑果实正丁醇部位中上述3种成分含量，并评价该部位抑菌活性，以期为该药材质量控制提供基础，也为今后开发天然广谱抗菌成分提供依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AB高效液相色谱仪，配置SPD-20A紫外检测器(日本岛津公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FA2004N型电子天平(上海菁海仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 刺山柑于2019年5月购于新疆乌鲁木齐市北园春批发市场，经新疆农业大学食品科学与药学学院药学系马生军副教授鉴定为正品。芦丁对照品(批号Y16M9S61523，纯度≥98%)、对羟基苯甲酸(批号MKBK3576V，纯度≥99%)(上海源叶生物科技有限公司)；异槲皮苷对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号MΜST-18051005，纯度≥99.74%)。0.22 μm有机相微孔滤膜(美国Thermo-Fisher公司)。色谱纯甲醇、乙腈(美国Sigma-Aldrich公司)；色谱纯甲酸、分析纯乙酸铵(国药集团化学试剂有限公司)；水为娃哈哈纯净水。

1.3 菌种 大肠杆菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]，均由新疆维吾尔自治区药检所提供。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取芦丁、异槲皮苷、对羟基苯甲酸对照品适量，甲醇制成1 mg/mL贮备液，吸取适量并混匀，甲醇稀释，即得(三者质量浓度均为10 μg/mL)，0.22 μm微孔滤膜过滤。

2.2 供试品溶液制备 取药材干燥果实，粉碎后过60目筛，称取200 g，按料液比1∶10用80%、50%乙醇各超声提取3次，每次50 min，提取液合并，减压浓缩得浸膏，混悬于等量蒸馏水中，按1∶2比例依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，得相应部位浸膏4.02 g，精密称取10 mg，10 mL甲醇溶解，即得，0.22 μm微孔滤膜过滤。

2.3 色谱条件 岛津Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相乙腈(含0.1%甲酸)-乙酸铵(含0.1%甲酸)(25∶75)；体积流量0.8 mL/min；柱温40 ℃；检测波长280 nm；进样量20 μL。色谱图见图1。

1. 芦丁 2. 对羟基苯甲酸 3.异槲皮苷图1 各成分HPLC色谱图

2.4 线性关系考察 将“2.1”项下贮备液用甲醇依次稀释成32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL对照品溶液，在“2.3”项色谱条件下各进样20 μL测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，分别以S/N=3、S/N=10为检出限、定量限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.5 精密度试验 精密吸取“2.1”项下对照品溶液20 μL，在“2.3”项色谱条件下进样测定6次，测得芦丁、对羟基苯甲酸、异槲皮苷峰面积RSD分别为1.88%、1.85%、1.79%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取正丁醇部位适量，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、10、12、24 h在“2.3”项色谱条件下各进样20 μL测定，测得芦丁、对羟基苯甲酸、异槲皮苷峰面积RSD分别为1.24%、1.77%、1.35%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取正丁醇部位适量，按“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下各进样20 μL测定，测得芦丁、对羟基苯甲酸、异槲皮苷峰面积RSD分别为1.60%、1.88%、1.81%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的正丁醇部位9份，分别80%、100%、120%水平加入对照品溶液[11]，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果(n=9)

2.9 样品含有量测定 取正丁醇部位6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果(mg/g，n=6)

2.10 抑菌活性研究 精密称取正丁醇部位浸膏1 g，加入1 mL DMSO充分溶解，得到1 g/mL供试液。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在无菌条件下接种于新鲜斜面固体培养基，置于37 ℃恒温培养箱中培养过夜进行活化，再接种于液体无菌LB培养基振荡培养。

取编号1-7的无菌离心管，无菌条件下在1号试管中加入5.4 mL LB液体培养基，其余各管加入3 mL。再于1号试管中加入0.6 mL供试液，充分混匀至100 mg/mL，吸取3 mL药液加到2号管中，振荡混匀后倍比稀释，吸取3 mL药液加到3号管中，以此类推，2～7号管中供试液质量浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。在各离心管中加入200 μL金黄色葡萄球菌的菌悬液，充分混匀后封口，37 ℃下恒温振荡培养18～24 h。采用活菌计数法测定细菌浓度[12]，以LB液体培养基将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌浓度调至1×106CFU/mL，取0.2 mL加到各离心管中。同时，另设只含LB液体培养基的空白对照及未加入细菌的阴性对照。

供试液在培养箱中培养24 h后，各取200 μL至无菌固体培养基平皿中涂板，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。以平板上无细菌生长或生长菌落数小于3个时对应的稀释度为最小抑菌浓度，平板上完全无细菌生长时对应的稀释度为最小杀菌浓度，平行3次，取平均值。结果，正丁醇部位对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别25、25、6.25 mg/mL, 最小杀菌浓度分别为50、32.5、12.5 mg/mL，即对三者抑制作用大小依次为枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌。

3 讨论

本实验考察了流动相甲醇-0.1%磷酸(10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50)、乙腈(含0.1%甲酸)-7.5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)(15∶85、25∶75、30∶70、35∶65、50∶50)及其等度、梯度洗脱方式[13-14]，发现与甲醇相比，乙腈洗脱能力、分离效果较好，最终确定为乙腈(含0.1%甲酸)-7.5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)等度洗脱(25∶75)。再考察了体积流量0.8、1.0 mL/min，发现在0.8 mL/min时芦丁、对羟基苯甲酸、异槲皮苷均能基线分离，分离度均大于1.5，理论塔板数以芦丁计均大于7 000。黄酮紫外光谱在240～400 nm波长范围内有2个吸收带，处于290～380 nm之间的为带Ⅰ，处于240～280 nm之间的为带Ⅱ，本实验通过SPD-20紫外检测器得到280、360 nm波长处对照品溶液色谱图[15-17]，发现芦丁、异槲皮苷均有较大吸收峰，而且色谱峰峰形良好，分离度理想，但对羟基苯甲酸在360 nm处无吸收峰，故选择280 nm作为检测波长。

综上所述，刺山柑果实正丁醇部位对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌)的抑制作用大于革兰氏阴性菌(大肠杆菌)；从形态结构分析，革兰氏阳性菌中肽聚糖含量较高，而革兰氏阴性菌中其含量较低，并且后者最外层外膜为脂多糖，表明活性成分可通过破坏肽聚糖结构来抑制细菌，但对脂多糖结构的作用较弱。