黄连等5种中药颗粒剂联合左氧氟沙星对鲍曼不动杆菌 生物膜的作用研究*

何宇巍，黄颖华，李晓君，谭俊青，黄小玲，王康椿，李蔼文

1 广东省第二中医院 广东广州 510095

2 中山大学南方学院 广东广州 510970

鲍曼不动杆菌广泛分布于自然界和医院环境中，是我国目前院内感染常见的病原菌。有报道显示[1]，临床分离的鲍曼不动杆菌生物膜具有非常强的形成率；生物膜一旦形成通过膜内细菌免受或者减少抗生素的侵扰等机制，细菌就具有了极强的耐药性和致病性[2-3]。

我们前期实验表明黄连、黄芩、连翘、乌梅、五味子等五种中药颗粒剂对鲍曼不动杆菌及其生物膜有不同程度的抑制作用。另一方面左氧氟沙星是临床上抗鲍曼不动杆菌感染常用的抗生素[4]。而现阶段国内外对鲍曼不动杆菌生物膜方面的研究主要集中在抗生素方面，中药及中药联合抗生素对鲍曼不动杆菌生物膜作用的研究及相关机制的研究鲜见报导[5-7]。为进一步探讨这些单体中药联合抗生素的抑菌机理，本研究通过筛选有效菌株、建立实验模型、进行体外联合用药实验，观察黄连等5种中药颗粒剂联合左氧氟沙星对多重耐药鲍曼不动杆菌（MDRAB）生物膜的抑膜效果，以期为治疗MDRAB联合用药提供新的思路，为中药制剂联合抗生素抗菌相关研究提供数据参考。

材料与方法

1 实验材料

1.1 菌株 2019年11月到2020年1月期间在广东省第二中医院检验科收集临床标本分离的MDRAB，均为非重复菌株，共11株。

1.2 药物及试剂 黄芩（9089261）、黄连（9035861）、连翘（9069171）、乌梅（8071961）、五味子（8031621），这5种中药颗粒剂均购于广东一方制药有限公司；左氧氟沙星氯化钠注射液（BW05731 第一三共制药有限公司）；95%乙醇（20181201 广东省广宁县顺宁葡萄糖药业有限公司）；龙胆紫染色液（419054 珠海贝索生物技术有限公司）；无菌盐水（190921501 广东怡翔制药有限公司）；0.45%盐溶液（3013691）；肉汤培养基（NUB-200302D 广州市迪景微生物科技有限公司）。

1.3 仪器与材料 VITEK-2型全自动细菌鉴定及药敏仪（法国梅里埃）； BSC-1100二级生物安全柜（山东鑫贝）； CX-21生物显微镜（OLYMUPS）；海尔冷藏冷冻箱（海尔）；YA28X6T高压蒸汽灭菌器（宁波甬安）；96孔细胞培养板（合肥博美生物科技有限责任公司）；电子天平（日本AD）；电热恒温培养箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）。

2 方法与步骤

2.1 用龙胆紫染色法筛选产膜的MDRAB

2.2 用微量倍比稀释法测定6种单药最小抑膜浓度

2.3 用棋盘稀释法测定各联合用药最小抑膜浓度

3 数据统计

3.1 先统计药物的最小抑膜浓度；再根据部分抑菌浓度指数计算FIC指数，当FIC指数小于等于0.5时，两种药为协同作用；当FIC指数大于0.5且小于等于1时，两种药为相加作用；当FIC指数大于l且小于等于2时，两种药为无关作用；当FIC指数大于2时，两种药为拮抗作用。

3.2 统计学处理 采用SPSS23.0软件处理，应用Fisher确切概率法检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 筛选产生物膜的鲍曼不动杆菌结果

收集了11株MDRAB，其中10株能产生生物膜，1株不能，产膜率为91%。其中10株产膜MDRAB将用于后续实验。

2 6种单药最小抑膜浓度结果

五种中药颗粒剂（黄连、黄芩、连翘、乌梅、五味子）在单独作用于MDRAB生物膜时，对MDRAB生物膜均有一定抑膜作用，实验结果显示不同药物的抑膜浓度不同，分别在2～16mg/mL不等，见（表1）；左氧氟沙星作用于MDRAB最小抑膜浓度为16μg/mL，见（表2）；经Fisher确切概率法检验可知，6种药相对比，不同药液浓度之间差异具有统计学意义（P=0.00，P＜0.05）。

表1 各中药颗粒剂作用于MDRAB最小抑膜浓度分布表

表2 左氧氟沙星作用于MDRAB最小抑膜浓度分布表

3 联合用药FIC作用结果

五种中药颗粒剂分别与左氧氟沙星两两联合用药的最小抑膜浓度FIC作用结果显示：黄连、黄芩、乌梅、五味子四种中药颗粒剂联合左氧氟沙星的FIC表现有协同、相加作用和无关作用，未见拮抗作用，其中这四种联合作用均以无关作用为主，占比分别为70%、40%、50%、60%；而连翘联合左氧氟沙星的FIC结果存在协同、相加和无关作用，主要表现为拮抗作用，占40%；从以上数据可以看出除连翘以外的四种中药颗粒剂在本次研究中联合左氧氟沙星对MDRAB的抑膜作用以无关作用为主，均可见协同、相加作用，而连翘联合左氧氟沙星对MDRAB的抑膜作用则出现了拮抗的情况，且拮抗占比最高，详见（表3）。在联合用药效应方面，根据Fisher确切概率法检验可知5组联合用药之间FIC结果分布差异没有统计学意义（P= 0.121，P＞0.05），即5组联合用药之间的FIC结果分布没有关联性。

表3 联合用药FIC指数分布表

讨 论

由于抗菌药物的广泛和不合理应用，使细菌的耐药性日趋严重，医院由鲍曼不动杆菌引起的感染呈逐年升高的趋势。而随着耐药性的提高，临床上联合用药的使用也越来越频繁，许多临床研究结果都表明了联合用药的优越性，中药与抗生素的联用也为联合用药提供新的思路以及参考依据[8-9]。

在本研究中，首先利用龙胆紫染色法筛选产生物膜的MDRAB，在临床分离的11株MDRAB中，其中10株为产生物膜的菌株，产膜率为91%，收集的菌株的生物膜形成率国内报道的结果相近[1，10-11]；以此10株作为实验菌株，然后用倍比稀释法分别测定5种单体中药对实验菌株的最小抑膜浓度，结果显示五种中药颗粒剂在单独使用时均对MDRAB生物膜有一定抑膜作用，抑膜浓度从2mg/ml-16mg/ml不等。我们前期研究也表明，该5种中药颗粒剂对多重耐药菌有不同程度抑菌作用，通过增加细菌细菌膜的通过性等机制达到抑菌的效果[12-14]；有研究表明[15]，中药五倍子水煎剂通过下调生物膜形成相关基因bfmS、bfmR、abaI、abaR、BAP的表达发挥抑制作用，从而达到抑制鲍曼不动杆菌生物膜形成的效果。本实验中实验药物对菌株抑膜作用的具体机制我们也在进一步研究中。

在中药颗粒剂和左氧氟沙星的联合药敏实验中，连翘联合左氧氟沙星的FIC主要表现为拮抗作用；而根据岳冬芳[16]，晏奎[17]等人对MDRAB有关联合用药的研究，磷霉素、头孢吡肟与左氧氟沙星联合使用后的FIC结果显示有拮抗作用，据研究分析，在部分菌株中存在拮抗作用，可能是由于部分菌株存在adeS基因，若使用某些药物可能会激活adeS基因，使外排泵表达或者过量表达，进入细菌细胞内的药物就会被泵出，从而表现为拮抗作用[3，18]；在连翘颗粒剂联合左氧氟沙星的抑膜研究中出现拮抗作用可能出现了上述相似机制，从而使其表现拮抗作用。其余四种中药颗粒剂联合左氧氟沙星的FIC主要表现为无关作用，而协同、相加也有少量散在分布，其中黄连颗粒剂联合左氧氟沙星的无关作用占比最高，达70%；表现为无关作用，可能与联合用药后两种药物的活性与单独一种抗菌药物作用相同有关[19-20]。

由本次联合用药研究结果可知，连翘在单独对MDRAB生物膜作用的实验中表现出了较差的抑膜效果，且在后续与左氧氟沙星联合用药的抑膜实验中，也存在着较高的拮抗作用，在MDRAB抑膜实验中，应考虑菌株的个体差异，或者避免使用此联用组合；而黄连、黄芩、乌梅、五味子等四种中药颗粒剂联合左氧氟沙星的抑膜实验中，协同、相加作用均有出现，以无关作用为主，不存在拮抗作用；在同类实验中，可考虑选用这些组合作进一步研究。本研究给联合用药提供了新的思路，在细菌耐药性越来越严重的今天，面临着超级细菌将无药可用的困境，中药与抗生素的联合使用可能是解决这个问题新的途径。