D-天冬氨酸(DAA)和锌镁合剂(ZMA)对大鼠合成代谢类激素的影响

王 贝，钱风雷，郑 澜，侯 彬，王 晨

(1.上海体育科学研究所，中国 上海 200030；2.上海市竞技体育训练管理中心，中国 上海 202162；3.湖南师范大学体育学院，中国 长沙 410006)

具有机能增补功能的营养补剂的研发一直是运动营养领域中的热门课题,尤其是合成类固醇补剂，是所有希望快速增加肌肉和力量以提高运动成绩的运动员和热衷于健美塑形的大众所关注的焦点。合成类固醇类似于合成雄性激素，其在结构及活性上与人体雄性激素睾酮相似。这类药物除了具有增加肌肉和力量，并在主动或被动减体重时保持肌肉体积的作用外，还可加快训练后的恢复，有助于增加训练强度和时间[1]。但是，几乎所有的口服合成类固醇都会致使肝脏功能异常，这些异常可从常见的无害表现到严重损伤不等，甚至会引发死亡[2，3]。除此之外，脱氢表雄酮(DHEA)和雄烯二酮(Andro)等可以转化为雄性激素的类固醇类补剂也是一些急于求成的健身爱好者的首要选择[4].但是类固醇类补剂的转化是否可以产生足够数量的性激素或者是否可以带来肌肉的生长尚存争议[5，6],而且副作用同样也尚不明了，但是肯定会扰乱机体自身的内分泌系统。目前，类固醇类补剂和合成类固醇在体育项目中被广泛采用，严重影响了体育比赛的结果和公正性，这些补剂现已被国际奥委会明确规定为违禁药品。

近年来，国际运动补剂市场出现了一些据称可以通过促进内源性雄性激素分泌从而加速肌肉生长的天然营养产品，其中包括D-天冬氨酸(D-Aspartic Acid， DAA)和锌镁补剂(ZMA)。DAA是一种非必需氨基酸，是广泛存在于无脊椎和脊椎动物的神经和内分泌组织中的一种内源性氨基酸，它的L-异构物是组成蛋白的20种氨基酸之一。ZMA是一种已获取专利的矿物质配方，包含30 mg锌(Zinc)和450 mg镁(Magnesium)，并配有11 mg维生素B6。DAA和ZMA补剂所含成分均为天然物质，目前尚无研究发现人体摄入后出现任何副作用。因此，以DAA和ZMA为主要成分的运动营养补剂的研究和开发可能会使广大健身爱好者和专业运动员受益。

DAA最先被发现存在于海洋软体动物的神经系统中，随后在别的动物包括人类的神经和内分泌组织中也陆续发现了DAA的存在[7，8]。高浓度的DAA被发现短暂出现在胚胎晚期的老鼠和人类的大脑内，说明DAA对于神经系统的发育有重要作用[7-9]。在内分泌系统中，高浓度的DAA被发现存在于老鼠出生时期和性成熟后的睾丸中[9]，说明DAA有助于精子的生成。进一步实验发现DAA可通过促进老鼠下丘脑分泌促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)，促进脑垂体分泌黄体生成素(LH)和促进睾丸分泌雄性激素从而激活下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴[10-12]。2009年，美国关于DAA补剂对老鼠和男性受试者影响的研究发现DAA补剂可明显提高LH和雄性激素水平[13]。在此实验中，23名27～37岁间的普通健康男性受试者12天连续摄入3.12 g DAA补剂后，他们的LH水平提高了33%，雄性激素水平提高了42%。这些研究结果的公布促使国外运动营养工业催生了大量含有DAA成分的营养补剂。2013年，Willoughby等[14]尝试让20名18～23岁间的抗阻训练运动员在28天的高强度力量训练期间同时摄入DAA补剂，结果发现每日3 g剂量的DAA并没有显著提高HPG轴的活动，也并未明显提高性激素水平。但是这次研究中受试者的雄性激素水平在受试前已经接近正常范围的上限，所以DAA对于雄性激素的促进作用有可能被HPG轴的反馈机制消除了，因为有研究指出为了保持雄性激素处于正常的生理水平，HPG轴的反馈机制可通过激活D-天冬氨酸氧化酶(DDO)从而降解DAA[15]。因此，DAA的促雄性激素分泌作用是否显著和其适用的人群范围仍需进一步研究[16,17]。

ZMA是在美国最先研发上市并获得专利证的一种复合矿物质运动补剂。其中锌属于必需微量元素，广泛参与许多重要的生化反应过程，并且是300多种酶正常工作的必要物质。锌与雄性激素间的相互关系在国外已被研究多年[18,19]。上个世纪60年代，文献[20]首次指出膳食中锌摄入不足可导致性腺功能低下和发育迟缓。随后的研究陆续证明导致雄性激素分泌下降的主要原因在于锌缺乏会损害GnRH及LH，促卵泡激素(FSH)功能[21]，改变雄性激素(TT)的酶转化[22]。锌缺乏症常见于大量出汗的运动员和业余运动爱好者并被认为可降低其免疫功能和运动成绩[23]。ZMA的第二种成分是参与许多细胞反应的基本元素镁，大概有300多种代谢反应以镁为辅助因子，包括糖酵解、脂肪和蛋白质代谢、ATP合成以及第二信使系统。调查报告称超50%的美国人膳食中镁摄入不足。镁的摄入不足可影响皮质醇浓度，而高浓度的皮质醇会影响肌肉量和肌肉力量等训练成果。1984年的研究发现连续14天摄入镁补剂显著降低了皮质醇浓度[24，25]。另一项研究显示镁补剂降低压力应激反应的同时仍维持了竞技能力[25]。ZMA中所含的维生素B6则被认为可帮助身体将蛋白质转化为能量并可促进锌镁的吸收[26，27]。因此，混合了锌、镁和维生素B6的混合补剂理论上可以提高合成代谢激素水平，降低分解代谢，从而增强免疫功能并提高力量训练成绩。2000年，在以对照组为比较的双盲实验中，12名NCAA二级联赛的橄榄球运动员摄入了8周的ZMA，结果显示ZMA组运动员的雄性激素提高了30%，肌肉力量提高了2.5倍[28]。然而，在最近发表的两组分别研究健康普通人[29]和抗阻训练运动员[30]的实验中，连续8周持续摄入ZMA并未明显改变受试者的激素水平、身体成分、肌肉力量和无氧运动能力。但是第一组实验受试者的日常锌摄入量均高于每日推荐量11 mg·d-1，而第二组实验受试者的空腹锌和镁的水平均处于正常范围，说明ZMA可能仅对锌镁流失较多和摄入不足的人群有显著作用。

虽然DAA和ZMA在国外运动营养补剂市场已经热销多时，但目前国外已有的研究数据仍存在一些争议，而国内对DAA和ZMA补剂的作用尚无研究数据发表。国外研究证明DAA和ZMA均在一定条件下可促进雄性激素的合成，但尚无研究尝试比较同时摄入DAA和ZMA是否比单独服用更有效。因此，本研究旨在这一领域进行探索，在国外研究的基础上进行DAA和ZMA的功效评定的动物实验，并比较两者的合并效果是否更加显著。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象与分组

从湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买雄性Spraque Dawley(SD)成年大鼠40只(二月龄)，在湖南师范大学体育学院运动生理实验室动物房常规条件下饲养至三月龄开始实验，室内温度保持在22～24 ℃,湿度保持在40%～60%，每笼饲养2～3只大鼠，确保进食和饮水自由。实验开始时将大鼠随机分为4组，每组10只，分别摄入DAA(DASP组)、ZMA(ZMA组)、DAA+ZMA(MIX组)和安慰剂(PLA组)4周。在最后一次给药后的第二天进行大鼠全身麻醉，颈部主动脉取血，随后断头处死。

1.2 给药方法

DAA和ZMA的生产商一般建议成年人每日摄入3.12 g DAA或者是3颗ZMA胶囊(每颗胶囊去皮质量0.78 g)，本实验按照体表面积给药原则(500 g大鼠和70 kg人的体表面积比为1/30)，连续四周让SD雄性大鼠每日摄入粉状DAA 104 mg/去皮ZMA胶囊77 mg。摄入方法为每日先提供给每只大鼠45 mL饮用水，其中添加104 mgD-天冬氨酸钠(Al Sports Nutrition, USA)/77 mg ZMA (SNAC，USA)，由于ZMA胶囊中的粉末较难溶于水，需提前加热至60 ℃，搅拌3 h至完全溶解。每日待大鼠将含有试剂的溶液饮用完全以后再添加饮用水供其随意摄取。

1.3 取样方法

停止给药后的第二天对大鼠进行取样。将10%水合氯醛注射入大鼠腹腔内进行全身麻醉。待麻醉生效后称量体质量，主动脉取血样，然后断头取睾丸、肾上腺、甲状腺、脑垂体和松果体等腺体。取到腺体后称取质量，睾丸取500 mg左右，其它腺体尽量取全部用于DAA检测。将所需腺体置于玻璃试管内并加适量生理盐水进行匀浆(睾丸加800 μL生理盐水，脑垂体和肾上腺各加300 μL,松果体和甲状腺各加200 μL生理盐水)，睾丸使用玻璃碾磨棒进行碾磨，其它腺体使用电动匀浆机进行匀浆。随后将匀浆液置于带盖离心管内，放入液氮中反复冻融3次裂解细胞膜，然后在离心机中3 000 r·min-1下离心15 min取上清液用于测试DAA含量。血样在离心机中3 000 r·min-1下离心15 min取上清液冷冻保存用于测试血清锌(Zn)、镁(Mg)、DAA、总睾固酮(TT)、游离睾酮(FT)、LH、雌性激素(ES)、生长激素(GH)、GnRH、DDO、胰岛素样生长因子(IGF-1)以及皮质醇(CORT)质量浓度。除Zn和Mg的测定采用原子吸收光谱法测定外，其它所有指标的测定均采用酶联免疫吸附测定方法(ELISA，BlueGene Biotech Co，LTD)。

1.4 数据处理

本研究采用SPSS 17.0 统计软件包对数据进行统计分析，结果以平均数±标准误表示。所有数据使用One-Way ANOVA作方差分析，并使用 LSD进行Post-Hoc两两比较显著性检验。p<0.05为具有统计学意义。

2 研究结果

2.1 大鼠基本情况

连续4周摄入DAA/ZMA后的SD大鼠平均体质量为574±4 g，各组间并无明显差别。

2.2 血清各指标的变化

与PLA组相比，连续4周摄入DAA显著增加了血清TT(p=0.042)和GH(p=0.039)。DASP组的血清FT也有增加趋势但并不显著(p=0.070)。虽然ZMA对所测血清指标并无显著影响，但与DASP组相比较,MIX组血清FT(p=0.005)，GH(p=0.007)和IGF-1(p=0.023)显著降低, 血清TT也降低了但并不显著(p=0.076)。与PLA组相比，ZMA组LH的浓度显著低于PLA组(p=0.047)，而MIX组LH的分泌被进一步抑制(p=0.039)。血清DAA，ES，GnRH，DDO及CORT浓度见表1，这些指标及Zn，Mg(数据未显示)浓度在各组间均无显著差异。

表1 4周后4组SD大鼠血清各指标质量浓度

2.3 腺体DAA含量的变化

图1 4周后SD大鼠睾丸DAA浓度Fig. 1 DAA levels in the testis after 4 weeks treatment with PLA, ZMA, DASP, or MIX

DASP组睾丸DAA含量比PLA组(0.036±0.002 vs.0.027±0.001 nmol·g-1，p=0.001)和ZMA组(0.036±0.002 vs. 0.020±0.004 nmol·g-1,p<0.001)显著增加(图1)。MIX组进一步提高了睾丸DAA的含量，显著高于PLA组(0.053±0.004 vs. 0.027±0.001 nmol·g-1，p<0.001)、ZMA组(0.053±0.004 vs. 0.020±0.004 nmol·g-1,p<0.001)和DASP组(0.053±0.004 vs. 0.036±0.002 nmol·g-1,p=0.001)。甲状腺、垂体、松果体和肾上腺样本中DAA含量在各组间无任何显著差异。

3 分析与讨论

本研究使用SD大鼠探究DAA和ZMA对于血清合成类激素的影响。实验结果显示DAA显著增加了血清TT和GH。这与前人的研究结果相一致。Topo等人[13]让4月龄的Wistar大鼠连续12天摄入20 mmol·L-1的D-天冬氨酸钠后发现大鼠的血清TT由5.1 μg·L-1显著增加为10.4 μg·L-1。D′Aniello等人[10]给3月龄的Wistar大鼠静脉注射0.5 mol·L-1的D-天冬氨酸钠，1 h后血清GH和LH浓度显著增加，5 h后浓度进一步增加，而血清TT在5 h后才显著增加，由此推断TT的增加可能是由于受到LH的刺激引发的。D′Aniello等人[10]通过一系列活体和离体的动物实验认为DAA会直接作用于脑垂体使之分泌更多的GH，而对于LH的影响则是间接通过刺激下丘脑分泌GnRH，GnRH随后再刺激脑垂体分泌LH。本研究结果中，DAA可能由于其直接刺激脑垂体显著提高了血清GH的浓度，但对于LH和GnRH浓度并没有显著影响，这可能是由于本实验用的SD大鼠LH和GnRH的基础值偏高，PLA组血清LH基础浓度为11.18 μg·L-1，远高于D′Aniello等人[10]活体实验中Wistar大鼠LH的基础浓度(3.7 μg·L-1)，略高于离体实验中LH的基础值(8.4 μg·L-1)，连续摄入4周的DAA后LH浓度虽然与基础值无明显差异(12.19 μg·L-1)但也略高于静脉注射5 h后的血清LH浓度(9.1 μg·L-1)，说明本实验中DAA对于HPG轴有一定但有限的作用。但是本实验中血清TT增加了72.5%，达到了20.34 μg·L-1，远远高于Topo等人[13]的实验中连续12天摄入DAA后的血清TT浓度(10.4 μg·L-1)，略高于D′Aniello等人[10]静脉注射5 h后的血清TT浓度(18.5 μg·L-1)，由此推断DAA可能通过其它的通道影响TT的分泌。Topo等人[13]发现在停止给药3 d后Wistar大鼠的血清LH恢复到基础值但TT仍维持显著较高水平，说明DAA可以直接刺激睾丸分泌TT。D′Aniello等人早期的研究结果[9]也证实了这一理论，他们在离体实验中发现培养在DAA溶液中的睾丸可合成TT。Topo等人[13]认为这是由于DAA可积聚在睾酮内从而可持续刺激其合成TT。本实验结果也显示连续4周摄入DAA显著提高了睾丸中的DAA含量。由此可见，本实验中DAA引起的血清TT的显著增加主要是由其对睾丸的直接作用引起的。

Brilla和Conte[28]在非橄榄球赛季的力量训练期间让运动员连续8周摄入ZMA补剂，结果显示ZMA可显著促进血清TT和IGF1的分泌并提高肌肉力量。本实验中SD大鼠连续4周摄入ZMA对所测各指标却并无显著影响，除了血清LH显著低于PLA和TT稍有增加但并无统计显著性，这可能与服药时间比较短有关。但笔者研究结果与Wilborn等人[30]和Koehler等人[29]的研究结果一致。Wilborn等人[30]让42名受过至少一年力量训练的男性受试者连续8周每晚睡前摄入ZMA胶囊。结果显示ZMA对所测的所有血清合成代谢激素，包括TT，IGF-1，GH和CORT，均无任何显著作用。这组实验的受试者的空腹锌和镁的水平均处于正常范围。而在另一个实验中，Koehler等人[29]让14位22～33岁的运动爱好者连续56天摄入ZMA后也没有发现血清TT和尿液中TT的代谢物与对比组相比有任何显著不同。这些受试者的日常锌的摄入量均高于每日推荐量11 mg·d-1。这两个实验结果说明ZMA可能仅对锌镁摄入不足的人群或者由于大量出汗而流失了过多锌镁的运动员有显著作用。本实验中的SD大鼠每日摄入的是标准的大鼠饲料并且没有进行任何规范的身体运动，因此它们的锌镁水平应当处于正常水平，加上服药时间较短，因此ZMA补剂的作用并不明显。

虽然本实验中ZMA补剂对合成类激素无明显影响，然而，当SD大鼠连续4周同时摄入DAA和ZMA时，虽然MIX组中积聚在睾丸的DAA含量达到最高值(原因尚不清楚)，但MIX组的血清FT，GH和IGF-1的浓度明显低于DASP组,血清TT和LH也呈下降趋势(虽然缺乏统计显著性)。考虑到DASP的血清TT浓度比PLA增加了72.5%，达到了20.34 mg·L-1,远高于其他文献的数据，因此推测ZMA对于血清TT具有一定的刺激作用，虽然单独使用时作用并不显著，但是当受试者的血清TT浓度很高时，ZMA可能会进一步刺激TT的分泌从而触发反馈抑制机制，降低血清TT浓度。TT的反馈抑制机制主要是通过HPG轴来实现的[31]。当血清TT增加时，TT会直接作用于下丘脑降低GnRH的分泌，然后通过抑制垂体分泌LH从而减少LH对睾丸的促TT分泌作用。TT还会直接作用于垂体，使之对GnRH的敏感度降低，从而减少LH的分泌。本研究结果中，各组间的血清GnRH浓度没有任何差异，但是MIX的血清LH和TT低于DASP，说明高浓度的血清TT降低了垂体对GnRH的敏感度从而降低了LH的浓度，对血清TT的合成分泌有一定的反馈抑制作用，这也可能是造成MIX的血清LH浓度明显低于PLA的主要原因。有研究指出为了保持雄性激素处于正常的生理水平，TT的反馈抑制机制还可通过激活DDO降解DAA，从而降低DAA对TT的促分泌作用[15]。本研究结果中，各组间血清DDO的浓度并无显著不同，但是由于没有测试DDO的活性，故无法确定是否DDO降解DAA从而抑制TT的分泌。另外，有文献指出DAA会增加睾丸芳香化酶的活性从而将TT转化为ES[32-34]。虽然本研究没有测试芳香化酶的浓度和活性，但是测试结果中血清ES浓度在各组间并无任何显著区别，因此通过芳香化酶转化为ES从而减少血清TT的反馈抑制机制在本实验中没有显著作用。

MIX组的血清GH和IGF-1浓度显著低于PLA组可能也是由GH和IGF-1共同的反馈抑制机制造成的[35]。DAA直接作用于脑垂体刺激分泌更多的GH，DASP组的血清GH明显增高,同时摄入ZMA后进一步刺激IGF-1的分泌，从而激发了反馈抑制机制，造成血清GH和IGF-1浓度降低。

4 结论

本研究通过连续4周让SD大鼠从饮水中摄入DAA/ZMA补剂，发现DAA可显著提高大鼠睾丸的DAA含量从而刺激睾丸分泌TT和FT，并可刺激脑垂体分泌GH。单独摄入ZMA对于血清合成类激素并无任何显著作用，但联合摄入ZMA和DAA却会引发TT和GH/IGF-1的反馈抑制机制。未来的研究须进一步探究DAA是否也能有效地促进人体合成类激素的分泌，ZMA是否能有效促进膳食中锌镁摄入不足或汗液流失过多的个体提高合成类激素的分泌以及联合力量训练是否可进一步促进肌肉的增长和力量。