低温和秋水仙素诱导植物细胞染色体数目变化的效果比较

许旭雯 虞 驰

（浙江省宁波市第四中学 浙江宁波 315016）

染色体的数目变化会引起生物性状的变异，在自然和人工条件下均能诱发植物细胞染色体数目的变异，借此所得到的多倍体或非整倍体植物对于作物遗传育种、扩大种质资源、培育新种等具有重要意义[1]。化学诱变是最常用的人工诱导植物细胞染色体增加的方法，常用的化学诱变剂包括秋水仙素、细胞松弛素B 等；而某些环境因素也会引起植物细胞染色体数目的变化，例如，在人教版高中生物学必修2 的第5 章“基因突变及其他变异”中，设置了“低温诱导植物细胞染色体数目变化”的探究实践活动[2]。

不同浓度的秋水仙素对于不同植物细胞染色体数目的诱导效果各有差异；引起染色体数目变异的不同诱导手段的作用机制不甚相同，其所产生的效果也不相同。低温诱导染色体数量增加的效率较低，对高中生而言，实验操作难度大，实验成功率不高[3]。基于此，本文旨在比较不同浓度秋水仙素处理下对同种植物细胞染色体数量增加效果的差异，验证低温诱导染色体数目变化实验的有效性与可操作性，探究低温和秋水仙素共同诱导下植物细胞染色体数目变化的效果。

1 材料与方法

1.1 实验器材

1）材料：大蒜（Allium sativum L.，2n=16）。

2）器具：培养皿、滤纸、纱布、烧杯、镊子、剪刀、显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、电子天平、称量纸、药匙、温度计、螺旋测微仪、4℃冰箱。

3）试剂：秋水仙素（沃凯生物，1 g）、卡诺氏液（海标科技，250 mL）、蒸馏水、质量浓度为0.01 g/mL的甲紫（龙胆紫）溶液、质量分数为15%的盐酸溶液、体积分数为95%的酒精溶液[4-5]。

1.2 实验方法

1.2.1 植物材料的处理 将大蒜置于装满清水的容器上方，使大蒜的底部接触水面，在室温（25℃）条件下进行培养，待其萌发出一定量的不定根后再进行诱导处理。隔天更换清水以保证水质干净，防止腐烂。

1.2.2 植物根尖的培养 用电子天平称取定量的秋水仙素粉末，配制成不同浓度的秋水仙素培养液：0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.10%。将萌发出不定根的大蒜随机分成等量且生长情况相同的14 组，分别用牙签固定于装有相应培养液的小烧杯中，使大蒜底部接触液面，对应地将整个装置置于室温（25℃）与低温（4℃）条件进行培养，不同组别实验条件设置见表1。不同处理组别中含多个大蒜样本。

表1 双因子实验条件设置表

1.2.3 根尖生长情况观察 植物细胞的有丝分裂具有日周期性，通常中午细胞分裂较旺盛，因此，在细胞分裂高峰期取材，有利于获得较好的观察结果。将各诱导处理组中的若干大蒜样本从烧杯中取下，并拍照记录。测定各组大蒜根尖0.1 cm 处的直径，每组至少20 次，记录数据。

1.2.4 分裂细胞的染色体观察 剪取诱导处理后的各组若干大蒜样本根尖处约0.5 cm 的组织，置于卡诺氏液中浸泡0.5 h，以固定细胞形态，然后用体积分数为95%的酒精冲洗2 次，并制作临时装片。将组织置于盛有解离液（盐酸和酒精1∶1 体积比的混合液）的玻璃皿中，在室温下解离3～5 min。待根尖软化后，用镊子取出，并置于盛有清水的玻璃皿中漂洗10 min。再将根尖浸入龙胆紫溶液中染色3～5 min 后，用镊子取出，置于载玻片上，盖上盖玻片。用橡皮轻轻敲打盖玻片，使细胞分散开。将制成的装片先置于低倍镜下观察，寻找染色体形态较好的分裂相，用高倍镜观察并拍照。

2 实验结果与分析

2.1 不同浓度的秋水仙素对大蒜根尖生长状况的影响 在室温（25℃）条件下，设置8 组不同浓度的秋水仙素培养液（0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.10%），分别处理大蒜的根尖约36 h，记录大蒜的不定根生长情况（图1）。由于室温条件下各处理组中若干大蒜样本的根尖生长状况趋势一致，因此，从各组中随机选取1 个样本以说明情况。在室温下，随着秋水仙素浓度的提高，根长显著变短。与空白对照组相比，加入秋水仙素处理的实验组在根尖处出现不同程度的膨大现象。测定各组大蒜根尖直径，每组取样20 次，通过统计分析各组根尖的直径表明：随秋水仙素浓度的提高，大蒜根尖处的直径不断增大，膨大现象逐渐明显（表2）。

图1 室温（25℃）条件下不同浓度秋水仙素溶液培养36 h 后大蒜不定根的生长状况（标尺为1 cm）

表2 室温（25℃）条件下不同浓度秋水仙素溶液培养的大蒜根尖分生区直径（n=20，平均值±标准误）

2.2 低温与不同浓度的秋水仙素共同作用对大蒜的根尖生长状况的影响 在低温（4℃）条件下，设置6 组不同浓度的秋水仙素培养液（0、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%），分别处理大蒜的根尖约72 h，记录大蒜的不定根生长情况（图2）。由于低温条件下各处理组中大蒜样本的根尖生长状况趋势一致，因此，从各组中随机选取1 个样本以说明情况。与室温条件下生长的大蒜根尖相比，在低温条件下生长的不定根生长速度明显减慢，持续培养72 h 才能达到在室温下培养36 h的根长。随着秋水仙素浓度的提高，不定根的根长同样显著变短。与空白对照组相比，加入秋水仙素的实验组在根尖处出现了不同程度的膨大现象，但与室温条件下相同秋水仙素浓度的实验组相比，膨大程度显著减轻。测定各组大蒜根尖直径，每组取样20 次，通过统计分析各组根尖的直径表明：仅低温条件即会造成植物根尖的略微膨大，但当与秋水仙素共同作用时，根尖膨大程度不及秋水仙素单因子实验的现象明显（表3）。

图2 低温（4℃）条件下不同浓度秋水仙素溶液培养72 h 后大蒜不定根的生长状况（标尺为1 cm）

表3 低温（4℃）条件下不同浓度秋水仙素溶液培养的大蒜根尖分生区直径（n=20，平均值±标准误）

2.3 不同浓度的秋水仙素对大蒜根尖分生区细胞染色体数目变化的影响 在室温（25℃）条件下，观察不同浓度的秋水仙素培养液处理下的大蒜根尖分生区的有丝分裂细胞，分别记录各实验组在分裂间期、有丝分裂前期、中期、后期和末期的染色体数目变化的情况（图3）。在室温条件下，随着秋水仙素浓度的提高，大蒜根尖分生区进行有丝分裂的细胞比例升高，分裂细胞内染色体的数量明显增加。其中，当秋水仙素浓度为0.01%时，分裂细胞内染色体的数量与清水组的区别不大；当秋水仙素浓度大于0.05%时，分裂细胞内染色体数量的增加极为明显。

图3 室温（25℃）条件下不同浓度秋水仙素处理的分裂细胞中染色体数目变化情况（标尺为50 μm）

2.4 低温与不同浓度的秋水仙素共同作用对大蒜根尖分生区细胞染色体数目变化的影响 在低温（4℃）条件下，观察不同浓度的秋水仙素培养液处理下的大蒜根尖分生区的有丝分裂细胞，分别记录各组在各个分裂时期的染色体数目变化的情况（图4）。与室温条件下不添加秋水仙素的对照组进行比较，在低温诱导时，大蒜根尖分生区分裂细胞中的染色体数明显增加。值得注意的是，相较于秋水仙素单因子实验结果，低温与不同浓度的秋水仙素共同作用时，诱导分裂细胞的染色体数目增加的效果没有出现叠加，且随着秋水仙素浓度的提高这种数目增加的效果反而被明显削弱了。

图4 低温（4℃）条件下不同浓度秋水仙素处理的分裂细胞中染色体数目变化情况（标尺为50 μm）

3 讨论

低温、秋水仙素单因子实验现象表明，低温和秋水仙素均能诱导植物细胞染色体数目增加，使大蒜根尖分生区的细胞数量增多，导致该区域出现肉眼可见的膨大现象。随着秋水仙素处理浓度的提高，染色体数量增加的程度及根尖膨大程度均显著提高，但低温条件下植物细胞生长分裂的速度放缓。

双因子实验现象表明，低温和秋水仙素共同诱导染色体数量增加的效果比秋水仙素单因子诱导增加的效果显著减弱。秋水仙素诱导染色体数目增加的作用机制主要是构成纺锤丝微管的微管蛋白上具有秋水仙素的亲和位点，当秋水仙素与之结合形成复合物时，便阻止了微管蛋白的继续聚合；且秋水仙素可促使微管蛋白解聚，改变微管组装和去组装之间的平衡，抑制纺锤体的形成[6]。此时，低温会引起细胞内微管蛋白或某些酶构型的改变，从而抑制微管蛋白聚合形成纺锤丝；且低温不利于细胞内各项酶促反应的进行，导致细胞分裂时ATP 的供应受阻，已完成染色体数目增加细胞的分裂活动被抑制[7-8]。秋水仙素在纺锤丝微管形成过程中起破坏作用，而低温条件下细胞的代谢活动减缓，纺锤体组装所需的能量与原料减少，即便添加秋水仙素也难以增强染色体数目增加的现象。

低温确实能在一定程度上诱导大蒜根尖分生区细胞内染色体数目的增加，且低温条件较易统一控制，实验成本较低，因此，教材中的实践探究也利用该处理办法诱导染色体数目变化。但低温处理后大蒜不定根的生长速率减缓，细胞分裂能力减弱，所以，在实验实际操作过程中也常存在成功率不高、分裂相细胞量少等缺点。

秋水仙素作为一种化学诱变剂，其使用安全问题仍难克服，因此，常建议采用低温诱导的方法。但秋水仙素诱导植物细胞染色体数目增加的效率极高，能有效地提高实验效率和成功率，若能注意使用安全，则能很好推广。本文研究结果显示，不同浓度的秋水仙素（0～0.1%）诱导植物细胞染色体数目变化的效果具有明显差异。当培养液中秋水仙素浓度过高时，细胞中的染色体数目增加过度，造成不必要的试剂损耗，同时由此导致的根尖膨大过度也会造成制片的困难。本实验中分裂细胞染色体观察结果表明，秋水仙素处理浓度控制在0.02%～0.03%为宜，此浓度下既能有效地观察到染色体数目增加的现象，又易于制作临时装片，实验成功率较高。