膨化秸秆微生物发酵饲料对杜寒杂交肉羊瘤胃微生物区系的影响

薛树媛， 李九月， 田 丰， 王晓飞， 王 超， 英 兰， 陈木兰

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特010031；2.兴安盟畜牧工作站，内蒙古乌兰浩特137400）

反刍动物瘤胃是一个较为复杂的发酵容器，其内寄居着种类繁多、数量庞大的微生物菌群，主要有细菌、真菌和纤毛虫（秦建有，2020；解彪等，2018）。这些微生物起着调节内环境以及分解动物机体中不能吸收的物质，并产生一些营养物质的重要作用。这些微生物中，细菌占比较大，所以研究瘤胃细菌的组成对于瘤胃内环境具有重要意义。优化瘤胃微生物有助于幼畜的健康生长，提高生产性能，减少环境污染，并能提高畜产品品质。哪些微生物在瘤胃中起着重要作用，以及改变饲料物理性状是否有助于瘤胃微生物在瘤胃内生长定植是此次研究的目的。本试验借助于高通量测序，以及多种分析方法探究膨化秸秆微生物发酵饲料对瘤胃微生物的具体影响。

1 试验材料与方法

1.1 试验设计 选择3月龄、体重为（23±1.0）kg的杜寒杂交羔羊81只，随机分为对照组（70%精料+30%干秸秆）、试验I组（70%精料+30%膨化秸秆微生物发酵饲料）和试验II组（70%精料+30%膨化秸秆微生物发酵饲料，再额外添加占日粮总蛋白浓度10%的膨化缓释尿素NPN≥100%），每组3个重复，每个重复9只羔羊。试验期共75 d，其中预饲期15 d，正饲期60 d。正饲期结束后，从各组随机挑选3只羊，空腹24 h后屠宰，采集瘤胃液，用4层纱布过滤，分装于15 mL冻存管，置于液氮罐中保存，用于提取瘤胃微生物DNA。

1.2 试验日粮 本试验使用的精料是按美国NRC（2007）标准配制并委托兴安盟九州大地饲料有限公司加工（表1）。粗饲料是由辽宁祥和农牧实业有限公司提供的膨化秸秆微生物发酵饲料和粉碎玉米秸秆。膨化缓释尿素（粗蛋白质≥100%）由内蒙古柯宏饲料有限公司提供。试验期日粮营养水平见表2。

表1 精料组成与营养水平（饲喂基础）

表2 试验期日粮营养水平（饲喂基础）

1.3 试验方法

1.3.1 瘤胃液基因组DNA的提取 采用SDS法提取样品基因组的DNA，再用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，在离心管中，用无菌水将样品稀释至1 ng/μL。

1.3.2 PCR扩增 PCR模板使用稀释后的样本基因组DNA；根据测序区域设计带Barcode的特异引物，其引物序列为：（341F 5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'；806R5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）。使用New England Biolabs公司的PhusionRHigh-Fidelity PCR MasterMix with GC Buffer的30μL体系进行PCR产物的扩增，反应体系见表3。

表3 PCR反应体系（30μL）

采用Bio-rad T100梯度PCR仪进行扩增，反应程序为：98℃预变性1 min；30个循环包括（98℃10 s；50℃30 s；72℃30 s）；72℃5 min。根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。

1.3.3 文库构建和上机测序 使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒进行文库的构建，经过Qubit定量和检测合格后，使用Thermofisher的IonS5TMXL上机测序。

1.4 数据分析 利用Trimmomatic软件将原始测序数据进行质控过滤，以序列末端的box序列校正序列方向，再按照barcode标签序列识别并区分样品得到有效数据。舍弃低质量序列（将read尾部质量值处于20以下的碱基过滤掉，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的read）。质控后的序列以16SrDNA序列97%的相似度进行分类划分。获得的OTU与RDP数据库进行比对，采用RDP classifier贝叶斯算法对相似度为97%的OTUs进行分类学分析，并在门、纲、目、科、属的各个水平下，统计每个样品的群落组成。用version v.1.30.1指数分析软件进行Alpha多样性分析，计算赵氏指数（Chao index）、艾斯指数（ACE index）、香农指数（Shannon index）及辛普森指数（Simpson index）。利用SAS 9.2统计软件单因素方差法分析不同处理组间的菌种丰度和Alpha指数，数据以“平均数±标准差”表示。

2 试验结果

2.1 膨化秸秆微生物发酵饲料对物种稀释曲线的影响 如图1所示，当序列数目达到60000时，曲线趋向于平坦，说明测序数量渐进合理。

图1 物种稀释曲线

2.2 膨化秸秆微生物发酵饲料对Venn图的影响如图2所示，对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组共有OTUs条目1935条，对照组与试验Ⅰ组共有OTUs条目2223条，试验Ⅰ组与试验Ⅱ组共有OTUs条目2273条，对照组与试验Ⅱ组共有OTUs条目2155条，对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组独有OTUs条目分别为203、270、498条，说明试验Ⅱ组物种丰度要高于试验Ⅰ组与对照组。

图2 Venn图

2.3 膨化秸秆微生物发酵饲料对物种相对丰度的影响

2.3.1 膨化秸秆微生物发酵饲料对门级别物种相对丰度的影响 从图3、表4可以看出，试验Ⅱ组变形菌门、芽单胞菌门显著低于其他两组（P=0.04），试验Ⅰ组与试验Ⅱ组广古菌门显著高于对照组（P=0.03），试验Ⅰ组与试验Ⅱ组酸杆菌门和绿弯菌门显著低于对照组（P＜0.05），试验Ⅱ组梭杆菌门显著高于试验Ⅰ组和对照组，试验Ⅰ组显著高于对照组（P=0.03）。试验Ⅰ组其他菌属显著高于其他两组，对照组高于试验Ⅱ组（P=0.01）。两试验组放线菌门趋于降低，但不显著（P＞0.05）。其余厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门组间无显著差异（P＞0.05）。

图3 瘤胃微生物门级别物种相对丰度

2.3.2 膨化秸秆微生物发酵饲料对属级别物种相对丰度的影响 如图4、表5所示，试验Ⅱ组未鉴别的-普雷沃氏菌属显著高于试验Ⅰ组和对照组，试验Ⅰ组显著低于对照组（P=0.03）。试验Ⅰ组拟杆菌属极显著高于试验Ⅱ组和对照组，试验Ⅱ组极显著高于对照组（P＜0.01）。试验Ⅱ组假单胞菌属显著低于试验Ⅰ组和对照组，试验Ⅰ组显著低于对照组（P=0.03）。试验Ⅱ组和对照组未鉴别的-疣微菌属显著高于试验Ⅰ组（P=0.04）。试验Ⅱ组和对照组的马赛菌属显著低于试验Ⅰ组（P=0.02）。两试验组的昆内拉菌属显著低于对照组（P=0.02）。试验Ⅱ组的甲烷短杆菌属显著低于试验Ⅰ组和对照组（P=0.03）。未鉴别的-拟杆菌属、帕拉拟杆菌属、巨单胞菌属和其他菌属差异不显著（P＞0.05）。

图4 瘤胃微生物属级别物种相对丰度

表5 膨化秸秆微生物发酵饲料对属级别排名前十占比的影响%

2.4 膨化秸秆微生物发酵饲料对Ternaryplot分析的影响 如图5所示，3个试验组中的门级别优势物种分别为拟杆菌门和厚壁菌门，且3个试验组丰度相近，可以说明拟杆菌门、厚壁菌门是所有健康羊只瘤胃内的优势菌种。

图5 三元相图（门）

如图6所示，三组中属级别优势物种为未鉴别的-普雷沃氏菌属、拟杆菌属、未鉴别的-拟杆菌属，不同组别丰度差异较大。

图6 三元相图（属）

2.5 膨化秸秆微生物发酵饲料对属水平物种进化树的影响 如图7所示，在属水平物种进化树中，进一步印证了三组中属级别优势物种为未鉴别的-普雷沃氏菌属、拟杆菌属、未鉴别的-拟杆菌属，且在每组中的丰度差异较大。

图7 瘤胃微生物属水平物种进化树

2.6 膨化秸秆微生物发酵饲料对门级别OTUs聚类热图的影响 从图8中可以看出，对照组的乳酸杆菌、广古菌门、酸杆菌门、疣微菌门、蓝细菌门、迷踪菌门、装甲菌门、绿弯菌门、纤细菌门、互养菌门、浮霉菌门这11个门高于其他两组。试验Ⅰ组黏胶球形菌门、螺旋菌门、厚壁菌门、俭菌总门、变形菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、己科河菌门这8个门高于其他两组。试验Ⅱ组软壁菌门、放线细菌、食氢菌门、硝化螺旋菌门、拟杆菌门、黑水仙菌门、纤维杆菌门、梭杆菌门、异常球菌-栖热菌门、胼胝菌门、硝棘菌门、衣原体门、乙酰菌门、奇古菌门这14个门均高于其他两组。由此可以看出，试验Ⅱ组丰度高于试验Ⅰ组与对照组的大多数为益生菌，而对照组则相反，丰度高于试验Ⅰ组与试验Ⅱ组的多数为致病菌。

图8 OTUs热图（门级别）

2.7 膨化秸秆微生物发酵饲料对等级聚类曲线的影响 等级聚类曲线可以直观反映样本中物种的丰富度和均匀度。在水平方向上，曲线的宽度反映了物种的丰富度，物种的丰富度越高，曲线在横轴上的跨度越大；在垂直方向上，曲线的平滑程度，表示样本中物种的均匀程度，曲线越平缓，表示物种分布越均匀（Lundberg等，2013）。从图9等级聚类曲线中可以看出，试验Ⅱ组的物种丰富度高于试验Ⅰ组和对照组，但三组的物种均匀度相似。

图9 瘤胃微生物等级聚类曲线

2.8 膨化秸秆微生物发酵饲料对Alpha多样性分析的影响 如表6所示，试验Ⅱ组的物种数目极显著高于试验Ⅰ组和对照组，试验Ⅰ组极显著高于对照组（P＜0.01）。试验Ⅰ组与试验Ⅱ组的香农指数显著高于对照组（P=0.04），试验Ⅰ组的赵氏指数极显著高于试验Ⅱ组和对照组，且试验Ⅱ组极显著高于对照组（P＜0.01）。试验Ⅱ组的艾斯指数极显著高于试验Ⅰ组和对照组，试验Ⅰ组极显著高于对照组（P＜0.01），辛普森指数组间差异不显著（P＞0.05）。

表6 膨化秸秆微生物发酵饲料对Alpha Indices统计的影响

2.9 膨化秸秆微生物发酵饲料对Beta多样性分析的影响 图10为基于Unweighted Unifrac Beta多样性的箱形图，由此箱型图可以看出对照组与试验Ⅰ组和试验Ⅱ组存在的差异均较大，而试验Ⅰ组与试验Ⅱ组间差异则相对较小。

图10 基于Unweighted Unifrac Beta多样性的箱形图

2.10 膨化秸秆微生物发酵饲料对Anosim分析的影响 图11为Anosim组间差异分析箱线图，从图中可知，试验Ⅱ组与其他两组存在显著差异，而对照组与试验Ⅰ组差异不显著，因此证明分组有意义。

图11 Anosim组间差异分析箱线图

2.11 膨化秸秆微生物发酵饲料对T检验的影响从表7中可以看出，直至科分类级别对照组和试验Ⅰ组才有组间差异物种。对照组与试验Ⅱ组间物种差异从属分类级别上至门分类级别，门分类级别的T检验依然显示差异显著。试验Ⅰ组与试验Ⅱ组在种分类级别上杆菌_MC2010种为组间差异物种，当分类级别高于目时，则没有组间差异物种，T检验呈现不显著。

表7 膨化秸秆微生物发酵饲料对组间分类水平差异物种的影响

2.12 膨化秸秆微生物发酵饲料对功能注释相对丰度的影响 如图12所示，三组中各样本在一级注释层级上相对丰度较高的功能比例差异不大，并且T检验呈不显著。所以各组样本中在一级注释层级功能注释差异不显著。

图12 功能注释相对丰度

3 结果与讨论

通过16s RNA的测序、分析，首先对测序所得序列进行筛选和拼接，得到需要的OTUs条目，再绘制稀释曲线，当序列条目达到60000时，曲线趋于平缓，说明已经注释到了大部分，可以进行后续分析。Venn图显示，试验Ⅱ组所独有OTUs条目近似于其他两组的二倍，试验Ⅱ组的物种丰富度比试验Ⅰ组与对照组更高，在后续的物种丰度柱状图、Ternaryplot分析、OTUs聚类热图、等级聚类曲线、Alpha分析中均显示试验Ⅱ组具有更高的物种丰富度，且有益菌丰度更高。Beta分析则显示，三组样本在物种丰富度上组间差异性较大，进一步证明试验Ⅱ组物种丰富度更高且有益菌丰度也比试验Ⅰ组与对照组高。Anosim（1999）分析证实了该分组方式有意义。T检验显示试验Ⅱ组与试验Ⅰ组、对照组的差异物种丰度较高，印证了上述分析。本试验中，试验Ⅰ组与试验Ⅱ组使用膨化秸秆微生物发酵饲料作为粗饲料，而膨化秸秆微生物发酵饲料相比于其他粗饲料具有更多的空隙，有助于微生物的附着繁殖，进而在瘤胃内增加了有益菌的丰度。 也有可能是由于膨化秸秆微生物发酵饲料的特殊物理结构，使其更易于消化吸收，二者联合作用，提高了羔羊生长性能，但具体作用机理还有待于进一步研究。

韩旭峰（2015）认为，不同日龄的陕北绒山羊瘤胃微生物组成成分是不同的，随年龄增长呈规律性变化，且瘤胃微生物也会因日粮中精料比例而发生变化。刘晶（2014）研究发现，当日粮中添加果胶时，果胶降解菌丰度会随之升高，日粮的组成对瘤胃微生物的物种丰度具有影响力。BaoShan Xing等（2020）认为，日粮中同时加入麦秸秆和高粱秸秆比单一加入一种秸秆时瘤胃内特异性降解菌丰度要高。Shoukun等（2016）研究发现，不同饲养方式下羔羊瘤胃微生物多样性有明显差异，舍饲条件下，瘤胃微生物多样性更高，有利于减少CH4排放。前人对精粗比、添加剂和放牧方式对瘤胃微生物的影响均有所研究，但是关于粗饲料不同物理状态对瘤胃微生物的影响则少有研究，所以本研究以粗饲料不同处理方式作为切入点，研究其对瘤胃微生物的影响。

直至科分类级别对照组和试验Ⅰ组才有组间差异物种，可能是由于拟杆菌属在物种丰度中占比较小，且拟杆菌属的种分类级物种分布较均匀，使得对照组和试验Ⅰ组在种分类级别没有特异性的差异物种。对照组与试验Ⅱ组间物种差异从属分类级别上至门分类级别，可能是由于甲烷短杆菌属、毛螺菌属在物种丰度中占比较大，致使门分类级别的T检验依然显示差异显著。试验Ⅰ组与试验Ⅱ组在种分类级别上杆菌_MC2010种为组间差异物种，当分类级别高于目时，则没有组间差异物种，T检验呈现不显著。

最终得出，试验Ⅱ组无论从物种丰度还是优势物种方面都优于试验Ⅰ组与对照组，继而证明膨化秸秆微生物发酵饲料提高蛋白水平后作为粗饲料有助于瘤胃微生物定植。

4 结论

玉米秸秆经膨化和微生物发酵处理后对试验羔羊瘤胃微生物区系有着明显的影响。改善了瘤胃微生物的丰富度，提高了瘤胃内如拟杆菌门、厚壁菌门、巨单胞菌属和普雷沃氏菌科等有益菌种的数量，成为优势菌群。以纤维类分解菌（普雷沃氏菌科）为代表的有益菌明显增多，并且明显降低了有害菌（假单胞菌）的种类和数量。