不同分子量茯苓多糖抑制酪氨酸酶活性及抗炎功效的研究*

刘晓英，马诗经，韩 萍，林 丽，杜志云，车 飙

[1.无限极（中国）有限公司，广东 广州 510000；2.佛山市康伲爱伦生物技术有限公司，广东 佛山 528200；3.广东工业大学生物医药学院，广东 广州 510006]

作为中药使用的茯苓，为多孔菌科（Polyporaceae） 真菌茯苓 [Poria cocos(Schw.)Wolf]的干燥菌核，常腐生或寄生于松科植物马尾松或赤松根部，也被称为松苓、茯兔、松柏玉等[1]，始载于《神农本草经》，被列为上品，也是我国药食两用的传统中药材，国内云南、安徽、湖北等为其主要产地[2]。茯苓味甘淡，性平，归心脾经，具有利水祛湿、健脾安神的功效[3]。研究发现，茯苓中富含多种化学成分，主要有三萜类、多糖类、甾醇类、氨基酸及微量元素等，其中三萜类和多糖类化合物为茯苓的主要活性成分[4]。现代药理学表明，茯苓具有增强免疫力[5]、降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗炎等功效[6-8]，被广泛应用于药品、食品及保健品领域中。皮肤色素主要包括黑色素、胡萝卜素、褐色素等，目前皮肤美白主要是通过抑制黑色素的形成[9]。此外，氧自由基、皮肤炎症及损伤也会导致皮肤色素增加或沉着[10]，因此抑制黑色素、褐色素的生成，以及消除皮肤自由基与炎症是美白肤质或降低色素沉着的有效途径。目前应用的美白功效成分主要包括烟酰胺、熊果苷、光甘草定、抗坏血酸、水飞蓟素、白藜芦醇等，尽管以上成分对黑色素的生成、转运、代谢等途径具有良好抑制作用，但存在添加量大、水溶性差以及价格昂贵等问题。因此，开发天然来源、功效明确、价格低、水溶性良好的美白因子具有重要意义。

近年来，研究揭示了茯苓中三萜类成分对酪氨酸酶具有良好的抑制作用[11-12]，而逐渐被用于开发美白护肤类化妆品，关于茯苓多糖在美白方面的功效及其作用机制研究比较少。因此，本研究对茯苓采用超微粉碎处理，再进行工业化生产常用的热水浸提工艺，以适宜的温度使得茯苓多糖充分溶出，进一步将茯苓粗多糖通过醇沉、膜分离方法得到纯化后茯苓多糖，并测定抗氧化活性、抗炎、抑制酪氨酸酶活性，分析不同截留相对分子质量所得茯苓多糖对自由基清除、抑制炎症、抑制酪氨酸酶活性的影响，以期为茯苓多糖在抗氧化、美白、消除炎症护肤方面的研究开发提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

茯苓，佛山市康伲爱伦生物技术有限公司；葡萄糖标准品（纯度＞99%），阿拉丁（Aladdin） 试剂公司；酪氨酸酶、二苯代苦味肼基自由基（DPPH）、脂多糖（LPS），上海西格玛有限公司；无水乙醇、浓硫酸、苯酚等均为分析纯，广州化学试剂厂；蒸馏水，实验室自制。

酶标仪1510，美国Thermo Fisher公司；UV-3600 Plus紫外可见光分光光度计，SHIMADZU公司；超微粉碎机WZJ-6B，济南倍力粉体工程技术有限公司；电热恒温水浴锅DK-S22，上海精宏实验设备有限公司；离心机Z326K，德国Hermle公司；数控超声波清洗器KQ3200DE，昆山市超声仪器有限公司；高速万能粉碎机DYF-400C，上海利闻科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 不同分子量茯苓多糖的制备

取茯苓干制品置于60℃烘箱干燥20 min后，经高速万能粉碎机粉碎并过100目筛，然后用超微粉碎机进行超微粉碎10 min，得到茯苓超微粉。参照参考文献[13]的方法并进行调整，称取1 kg茯苓超微粉加入水，料液比为1∶30，浸泡20 min后100℃下提取2 h，经300目过滤，滤液备用。滤渣再加入水，料液比为1∶15，按上述条件重复提取1次，合并提取液经300目过滤后，65℃减压浓缩至体积的1/10。经5 000 r·min-1离心10 min，取上层清液加入4倍体积的95%乙醇进行沉淀后减压抽滤，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤3次。将沉淀物冷冻干燥（-50℃，48 h）成粉末后，按照文献方法进行脱蛋白处理5次[14]，再经冷冻干燥（-50℃，48 h），得茯苓多糖冻干粉（记为PW-P1），测定粗多糖含量。

采用醇沉、联合膜分离工艺制备茯苓多糖[15-16]。取离心后的茯苓提取液，在0.1 MPa、30℃、截留相对分子质量为5 kDa、10 kDa超滤膜条件下进行超滤，分别收集截留相对分子质量为5 kDa、10 kDa的茯苓提取液，并在65℃浓缩至提取液体积的1/10，浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，放置过夜后，5 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液得沉淀，并按1.2.1项下方法脱蛋白后冷冻干燥（-50℃，48 h）得茯苓多糖冻干粉，分别将截留相对分子质量为5 kDa、10 kDa超滤膜分离所得的茯苓多糖将记为PW-P2、PW-P3，进行体外活性测试。

1.2.2 茯苓多糖含量测定

1） 葡萄糖标准曲线的制作

采用苯酚硫酸法测定[17]，称取适量葡萄糖标准品，置于105℃烘箱中烘至恒重后，称取100 mg葡萄糖标准品，在100 mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。精密吸取葡萄糖标准储备液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，置于 10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，配制成含葡萄糖0、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1的系列葡萄糖标准溶液。分别移取上述系列葡萄糖标准溶液各1 mL，置于10 mL具塞玻璃试管中，依次加入0.5 mL的5%苯酚溶液，2.5 mL浓硫酸摇匀，静置5 min，90℃水浴加热20 min，然后冰浴冷却至室温。另取1 mL蒸馏水，按照上述操作，作为空白对照。将上述溶液分别在490 nm波长处测定吸光度值，以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2）茯苓多糖含量的测定

取茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3溶于水中，并稀释至一定质量浓度，吸取1 mL于10 mL具塞试管中，按照1.2.2中1） 项的步骤进行操作，测定吸光度值，由标准曲线计算出多糖浓度，按以下公式计算茯苓多糖含量（X，%）：

式中：C为测得茯苓多糖的浓度（mg·mL-1）；V为提取液的体积（mL）；n为稀释倍数；0.9为葡萄糖换算成多糖的正交系数。

1.2.3 茯苓多糖DPPH自由基清除能力的测定

参照参考文献[18]方法，测定茯苓多糖PWP1、PW-P2、PW-P3的DPPH自由基清除能力。分别取 1 mL 浓度为 0.01 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、 0.20 mg·mL-1、 0.40 mg·mL-1、 0.80 mg·mL-1的PW-P1、PW-P2、PW-P3溶液于试管中，分别加入0.1 mmol·L-1DPPH溶液1.0 mL，充分混匀后避光反应20 min，在517 nm处测定吸光度值Ai。VC做为阳性对照，对照组以无水乙醇代替DPPH溶液，测定吸光度值Aj。空白组以蒸馏水代替多糖溶液，测定吸光度值为A0。DPPH自由基清除率（C，%）的计算公式为：

式中：A0为空白组吸光度值；Ai为茯苓多糖吸光度值；Aj为对照组吸光度值。

1.2.4 茯苓多糖对RAW264.7细胞的作用

测定茯苓多糖对RAW264.7细胞的作用[19-20]。小鼠巨噬细胞系RAW264.7在含有10%FBS胎牛血清、1%双抗（链霉素100 mg·mL-1、青霉素100 U·mL-1）和90%DMEM完全培养基中培养。待细胞长满培养瓶后，按体积1∶3的稀释比对细胞进行传代培养。在 96孔板中加入 8×103个/孔对数期生长的RAW264.7细胞，37℃、5%CO2条件下孵育过夜。加入浓度为 0～100 μg·mL-1的茯苓多糖 PW-P1、PWP2、PW-P3处理24 h，每孔中加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，培养箱内避光孵育4 h后弃上层培养基，加入100 μL DMSO解甲醛染料，避光震荡10 min，用酶标仪于492 nm处测定吸光度值。

1.2.5 茯苓多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞NO分泌量的影响

细胞株用内含10%FBS的DMEM高糖培养基于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，细胞呈对数生长，每24小时更换培养基，细胞生长至60%～70%传代。细胞分组及干预细胞分为12组，分别为空白组、LPS模型组、PW-P1组、PW-P2组、PW-P3组。取对数生长期的RAW264.7细胞株，以2×106个/mL的密度接种于6孔板上，培养箱中孵育24 h后给药。空白组加入完全培养基，LPS组加入使最终质量浓度为2 μg·mL-1的LPS，给药组分别加入使最终质量浓度为 50 μg·mL-1、250 μg·mL-1、500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1的样品和 2 μg·mL-1的 LPS，使每组的总体积为3 mL，并放入细胞培养箱中继续培养24 h。

收集细胞上清液，严格按照NO检测试剂盒说明书进行测定。采用完全培养基作为稀释液稀释原始浓度为1 mol·L-1的标准品溶液NaNO2。按照150 μL/孔，在96孔板中加入各浓度的对照品溶液及样品50 μL，Griess Reagent Ⅰ液及Ⅱ液各 50 μL，于 37℃培养箱中孵育10 min。振荡器上震荡5 min后于酶标仪540 nm处测定记录各孔吸光度值。

1.2.6 茯苓多糖对酪氨酸酶活性的抑制作用测试

研究报道酪氨酸酶可以催化L-多巴生成多巴色素，多巴色素在波长475 nm处具有最大吸收值。参照参考文献[12]的方法并略作调整，酪氨酸酶活性抑制试验利用L-酪氨酸作为底物进行催化反应，用比色法于475 nm处测定吸光度变化。选择抑制反应试验条件为：温度37℃，水浴恒温10 min，pH6.8，再反应时间10 min，加入L-酪氨酸的浓度为0.6 mmol·mL-1，酶液量为1.0 mL（97 IU·mL-1）。反应中不同浓度的样品溶液 （包括 0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、6.0 mg·mL-1的茯苓多糖；0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1的 VC）、二甲亚砜 （DMSO）、磷酸缓冲液（PBS）、酪氨酸酶液及L-酪氨酸的添加量见表1，各比色管分别编号为1号、2号、3号、4号。将水浴锅内的比色管取出，快速测定其在475 nm处的吸光度值。重复以上步骤，进行3次平行实验，求得平均值，按以下公式计算酪氨酸酶酶活的抑制率（IR，%）：

表1 待测液的组成Tab.1 Composition of samples prepared for test of tyrosinase activity

式中：A1为1号比色管溶液的吸光度值；A2为2号比色管溶液的吸光度值；A3为2号比色管溶液的吸光度值；A4为2号比色管溶液的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 茯苓多糖的含量测定

以葡萄糖标准液浓度（mg·mL-1）为横坐标，吸光度值（Abs）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

得到的葡萄糖标准液线性回归方程为：

回归方程的相关系数R2为0.999 8，表明葡萄糖标准品在0～0.10 mg·mL-1内浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

进一步测定茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3的粗多糖含量，见表2。

表2 茯苓多糖的粗含量Tab.2 The content of Poria Cocos(Schw.)Wolf polysaccharides

如表2所示，茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PWP3的粗多糖含量分别为96.46%、93.18%、92.25%。

2.2 茯苓多糖的DPPH自由基清除率

采用醇沉、联合膜分离技术经纯化得到不同分子量范围的茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3，进一步通过体外抗氧化测试，评价其对DPPH自由基清除效果，并与VC进行对照，对DPPH自由基清除率结果见图2。

图2 茯苓多糖的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging rate of Poria cocos polysaccharides

如图2所示，在设定的质量浓度范围内，不同分子量的茯苓多糖对DPPH自由基的清除率呈现出浓度依赖性，PW-P1、PW-P2、PW-P3在质量浓度为 0.01 mg·mL-1～0.40 mg·mL-1对 DPPH 自由基清除率范围分别为3.65%～29.75%、5.92%～31.44%、7.39%～62.74%。质量浓度为0.8 mg·mL-1时，对DPPH自由基清除率分别为39.35%、49.88%、62.74%。计算得到 PW-P3的 IC50为 0.45 mg·mL-1，而 PW-P1与PW-P2的IC50则大于0.8 mg·mL-1。在同样浓度下，VC对DPPH自由基清除率高于PW-P1、PW-P2、PW-P3，其IC50为0.14 mg·mL-1。从以上抗氧化结果分析，对不同分离工艺获得的茯苓多糖抗氧化功效而言，截留相对分子质量为10 kDa的PW-P3抗氧化功效优于截留相对分子质量为5 kDa的PW-P2、醇沉分离的PW-P1，说明不同分离工艺影响茯苓多糖的抗氧化活性，可能与其分子量的大小有关。

2.3 茯苓多糖对RAW264.7细胞活性的影响

茯苓多糖对RAW264.7细胞活性影响的结果见表3。

表3 茯苓多糖对RAW264.7细胞活性的影响Tab.3 The effect of Poria cocos polysaccharides on RAW264.7 cell viability

如表3所示，不同浓度的茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3处理RAW 264.7细胞24 h后，使用MTT法检测细胞活性发现，在浓度为1 μg·mL-1～1 000 μg·mL-1茯苓多糖作用下，RAW264.7 细胞活性均保持在93%以上。与对照组的细胞活性相比，不同工艺分离的茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3在上述剂量范围内对RAW264.7细胞增殖没有明显的抑制效果，后续采用该系列浓度进行抑制RAW264.7细胞NO分泌的测试。

2.4 茯苓多糖对LPS诱导RAW264.7细胞NO分泌的抑制作用

细菌、真菌、组织外伤、紫外线、外源性化学物质等都有可能诱发机体炎症，脂多糖LPS（lipopolysaccharide，LPS） 是革兰氏阴性菌细胞壁外壁的组成成分，作用于机体时容易引起强烈炎症反应。LPS诱发炎症发生过程，由NO合酶（nitric oxide synthase，NOS） 催化 L-精氨酸 （L-Argine） 而生成一氧化氮（nitric oxide，NO），被LPS激活的巨噬细胞可以大量分泌NO，导致周围组织的损伤[21]。采用浓度为 50 μg·mL-1～1 000 μg·mL-1的茯苓多糖 PW-P1、PW-P2、PW-P3 作用于浓度为 2 μg·mL-1LPS诱导的RAW264.7细胞，考察不同分子量的茯苓多糖对RAW264.7细胞分泌NO的影响，结果详见表4。

表4 茯苓多糖对LPS诱导RAW264.7细胞NO分泌的抑制作用Tab.4 Inhibitory effect of Poria cocos polysaccharides on NO secretion induced by LPS in RAW264.7 cells

由表4可知，与空白组相比，LPS干预后的RAW264.7细胞模型组分泌的NO显著升高（P＜0.001），说明了在此浓度下的LPS对RAW264.7细胞造成了显著的炎症性反应。与模型组相比，茯苓多糖 PW-P2、PW-P3 在浓度为 50 μg·mL-1～1 000 μg·mL-1对LPS诱导NO的分泌具有显著的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），茯苓多糖 PW-P1 则在浓度为 250 μg·mL-1～1 000 μg·mL-1时能显著降低NO的分泌 （P＜0.05，P＜0.01），且呈浓度依赖性。与PW-P1相比，经过超滤截留收集所得相对分子量较为集中的茯苓多糖PW-P2、PW-P3，在低浓度时显效抑制LPS诱导产生NO，初步实验结果与刘晓菲等[22]采用经纯化后羧甲基茯苓多糖对对脂多糖（LPS） 诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7有一定抑制作用的结果一致。

2.5 茯苓多糖对酪氨酸酶活性的影响

在人体皮肤黑色素合成的过程中，酪氨酸酶及其活性起着关键作用[23]，目前评价中草药提取物美白功效的体外常用方法为抑制酪氨酸酶活性试验[24]。研究证实茯苓中三萜类物质对酪氨酸酶具有抑制作用[11-12]，但茯苓多糖对酪氨酸酶的活性影响却鲜有报道。为了分析茯苓多糖对酪氨酸酶活性的影响，采用浓度为 0.5 mg·mL-1～6.0 mg·mL-1茯苓多糖PWP1、PW-P2、PW-P3，以及浓度为 0.1 mg·mL-1～0.5 mg·mL-1VC测定酪氨酸酶的抑制率，结果见表5。

表5 茯苓多糖对酪氨酸酶的抑制率Tab.5 Tyrosinase inhibition rate of Poria cocos polysaccharides

由表5可知，在浓度0.5 mg·mL-1～6.0 mg·mL-1范围内的茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3对酪氨酸酶活性有一定的抑制作用，并且随着质量浓度的增加抑制作用逐渐增强，在浓度为6.0 mg·mL-1时，茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3对酪氨酸酶活性的最大抑制率分别为24.21%、35.39%、38.11%，也进一步说明不同分离工艺影响茯苓多糖的抑制酪氨酸酶活性，其可能与茯苓多糖的分子量大小有关。VC在浓度为0.5 mg·mL-1时对酪氨酸酶活性抑制率为69.47%，其IC50为0.39 mg·mL-1。尽管在设定浓度范围内，茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3均未达到酪氨酸酶IC50抑制率，但仍能够有效地抑制酪氨酸酶活性，由此可见，茯苓多糖PW-P1、PWP2、PW-P3可作为一种天然美白活性成分应用于美白类化妆品。

3 结论

本研究采用超微粉碎预处理热水浸提法提取茯苓多糖，通过醇沉、联合膜分离的不同分离方法制备茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3，其粗多糖含量分别为96.46%、93.18%、92.25%。进一步测定茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3的DPPH自由基清除率、LPS诱导RAW264.7细胞NO分泌的抑制率及酪氨酸酶活性抑制率，均呈现出良好的量效关系，同时试验初步证实在此工艺条件下制得的茯苓多糖，具有一定的抗炎及抑制酪氨酸酶的活性，且与茯苓多糖不同分子量分布有关，而茯苓多糖的抗炎、美白活性及其作用机理还有待进一步研究。这为茯苓多糖的体内抗炎及美白研究提供了理论依据，为茯苓的精深加工应用提供了参考。