桦褐孔菌诱变菌株ITS分子鉴定及菌丝体活性成分比较*

尹钰涵，刘 迪，2**，陈功鑫，王 璐，王 皓，滕成龙，郭建峰，王楚航

[1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2.延边大学农学院，食（药）用真菌研究所，吉林 延吉 133002]

桦褐孔菌[Inonotus obliquus（Ach.Ex Pers.）Pilát]是一种较为罕见的天然食（药） 用真菌，属菌物界（Fungi）担子菌门（Basidiomycota）伞菌纲（Agaricomycetes） 锈革孔菌目（Hymenochaetales） 锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）[1-2]。早在16世纪至17世纪，俄罗斯人就发现服用桦褐孔菌具有保健的功效，研究表明桦褐孔菌中有着丰富的药用成分，如桦褐孔菌醇、多糖、三萜类、黄酮类、黑色素、丁香酸、木脂素类、叶酸衍生物等，具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗衰老、调节免疫力等药理作用[3-8]。其中，桦褐孔菌中多糖是公认的有效的降糖成分之一[9]，同时其能够清除活性氧自由基，起到抗氧化的作用[6]；桦褐孔菌醇能够抑制α-葡萄糖苷酶活性，以及降低高脂血症大鼠血清总胆固醇、高三酰甘油水平[10]。紫外辐射诱变育种技术主要是通过引起DNA分子结构发生改变，从而引发菌株变异的一种简单、有效的育种技术之一。目前，已有利用紫外线育种其他食用菌的相关报道[11-12]，但利用紫外线进行桦褐孔菌育种鲜为少见。国内野生桦褐孔菌生长非常缓慢，资源较为匮乏，价格逐渐上涨，因此通过人工培育高活性成分产量的桦褐孔菌十分必要。通过对桦褐孔菌菌株进行紫外线辐射的诱变处理，通过拮抗试验及ITS序列分析对诱变菌株进行初步鉴定，并对其活性成分进行比较，以确定诱变菌株高产活性成分，为其生产育种提供理论依据。

1 试验材料

1.1 供试菌株

桦褐孔菌原菌株JL01、紫外线诱变菌株HZ1、桦褐孔菌原菌株菌核HE（由菌株JL01栽培获得），均保存于延边大学农学院食（药）用真菌研究所。

1.2 试剂及仪器

NuClean Plant Genomic DNA Kit试剂盒，北京康为世纪公司；Agarose琼脂糖，Biowest公司；2xTaq PCR MasterMix、D2000型 DNA Marker等，TaKaRa Bio公司；通用引物ITS1、ITS4，福林酚显色剂，无水葡萄糖标准品（纯度≥98%，批号SG8510），北京宝莱科技有限公司；芦丁（纯度≥98%，批号Y10549），北京百奥莱博科技有限公司；没食子酸（纯度≥98%，批号B20851）、齐墩果酸（纯度≥98%，批号B20954），上海源叶生物科技有限公司；其他试验试剂均为分析纯；试验用水采用娃哈哈纯净水。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯200 g（蒸馏水煮沸，经4层纱布过滤）、葡萄糖20 g、琼脂20 g，加水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min。

BioDoc-It220型凝胶成像系统，美国UVP；Hitachi高速冷冻离心机，日本日立；T100型梯度PCR仪，美国伯乐；HVE-85型立式压力蒸汽灭菌器，日本HIRAYAMA；HF-I50A电热恒温鼓风干燥箱，金坛恒丰仪器厂；FA11004A型电子天平，上海精天电子仪器有限公司；DK-42OS型电热恒温水浴锅，上海精宏试验设备有限公司；KQ-250B超声波清洗器，昆山舒美超声仪器有限公司；U-1800型紫外可见光分光光度计，日本日立。

1.3 样品制备

在无菌条件下，将桦褐孔菌JL01、HZ1母种分别接种于PDA固体平板中，置于28℃的遮光恒温培养箱中暗培养15 d，每组设置5个重复，每日观察并记录。待菌丝体长满平板后用刀片刮取，避光保存于-80℃超低温冰箱。

1.4 基于桦褐孔菌ITS序列的分子生物学鉴定

1.4.1 基因组DNA提取

取0.1 g菌丝体经液氮研磨成粉末状，按照Nu－Clean Plant Genomic DNA Kit试剂盒说明提取总DNA，-20℃保存。

1.4.2 分子学鉴定

利用真菌ITS通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 和 ITS4 （ 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），对 ITS1、ITS2 区及 5.8S rDNA序列进行扩增（引物由北京索莱宝科技有限公司合成）。PCR反应在梯度PCR仪扩增，其25 μL反应体系中各成分体积见表1。

表1 PCR扩增反应体系组分Tab.1 Components of PCR reaction system

扩增程序：94℃预变性4 min，55.5℃退火1 min，72℃延伸4 min，进行35个循环；72℃延伸5 min。产物于长春生工生物工程股份有限公司进行测序。通过NCBI数据库中在线BLAST分析及DNA star软件对测序获得的ITS序列进行分析。

1.5 样品活性成分含量

将收集的菌株JL01和菌株HZ1培育的菌丝体及菌核（由菌株JL01栽培获得），置于电热恒温干燥箱内50℃烘至恒重，粉碎成粉末过40目筛。

1.5.1 多糖含量提取及测定

采用热水浸提法，精密称取干燥桦褐孔菌粉末0.5 g待测样品置于试管中，加入15 mL蒸馏水置于83℃水浴锅中提取3.4 h。过滤收集上清液，浓缩至5 mL，加入4倍浓缩液的95%乙醇溶剂，4℃静置醇沉12 h。4 000 r·min-1离心10 min收集沉淀，烘干至恒重，加入4 mL蒸馏水复溶，溶液用于粗多糖含量测定。

葡萄糖标准品溶液（100 μg·mL-1）：称取0.1 g葡萄糖标准品于100 mL烧杯中，加蒸馏水溶解，定容至1 000 mL，4℃保存，分别吸取0、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL的葡萄糖溶液于试管中，蒸馏水补至1.0 mL。分别加入1 mL的5%苯酚溶液，快速加入5 mL硫酸，静置10 min，摇匀，将试管置于30℃水浴中反应20 min，在490 nm紫外分光光度计下测定吸光度值。以葡萄糖质量浓度（μg·mL-1）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，葡萄糖标准品线性回归方程为：

该线性回归方程的R2为0.995。

1.5.2 黄酮含量提取及测定

采用超声辅助浸提法，精密称取0.5 g待测样品置于试管中，按料液比1∶20加入50%乙醇溶液置于试管中，60℃超声提取50 min，4 000 r·min-1离心20 min，回收上清液，50%乙醇定容，即得黄酮提取液。

芦丁标准品溶液（200 μg·mL-1）：称取0.01 g芦丁标准品溶于400 mL无水乙醇，得母液。分别吸取 0、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL母液，加入60%乙醇溶液5 mL，5%的NaNO2溶液 0.5 mL，摇匀静置6 min，10%的 Al（NO3）3溶液0.5 mL，摇匀静置6 min，4%的NaOH溶液4 mL，摇匀静置20 min，将反应液于紫外分光光度计510 nm波长下测量吸光度值。以芦丁质量浓度（μg·mL-1）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制黄酮标准曲线，芦丁标准品线性回归方程为：

该线性回归方程R2为0.995 3。

1.5.3 多酚含量提取及测定

采用超声辅助浸提法，精密称取0.5 g待测样品置于试管中，按料液比1∶40加入50%乙醇，于50℃温度下超声30 min，4 000 r·min-1离心20 min，回收上清液，50%乙醇定容，即得。

该线性回归方程R2为0.992 4。

1.5.4 三萜含量提取及测定

采用超声辅助浸提法，精密称取0.5 g待测样品置于试管中，按料液比1∶23加入异丙醇溶液，60℃下超声提取22 min，4 000 r·min-1离心 20 min，定容，即得。

齐墩果酸标准品溶液（0.2 mg·mL-1）：称取齐墩果酸标准品0.01 g，加入甲醇溶液50 mL，得母液。分别吸取0、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL母液，水浴挥尽溶剂，分别加入新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和0.8 mL的高氯酸，75℃水浴反应15 min，冰水冷却，摇匀，在550 nm波长下测定吸光度值，以齐墩果酸质量浓度（mg·mL-1）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制三萜标准曲线，齐墩果酸标准品线性回归方程为：

该线性回归方程R2为0.992 4。

1.6 数据处理

粗多糖、总黄酮、总多酚、三萜含量分别以葡萄糖、芦丁、没食子酸齐墩果酸含量（mg·g-1）表示；试验过程中每组试验设置3组平行，结果以平均值±标准差表示。通过 SPSS 17.0、Graph Pad Prism 7.0、Excel软件对数据进行方差分析等处理。

2 结果与分析

2.1 菌丝体生长差异比较分析

将桦褐孔菌菌株于PDA培养基上培养15 d，菌落形态见图1。

研究［9］表明联合固定方法具有明显生物力学优势。Schliemann等［6］用锁定板加单袢钢板重建喙锁韧带技术治疗锁骨远端骨折14例，与健侧相比，患肩平均Constant-Murley评分（93.5分vs 97.2分）和平均CCD（10.5mm vs 12mm）均无明显差异，仅3例出现喙锁韧带钙化，无内固定失败或切口感染、血肿等并发症。Anderson等［8］报道20例锁定板治疗不稳定型锁骨远端骨折术中有9例需附加聚酯缝线、带线锚钉或喙锁螺钉，这些附加喙锁固定者均达到骨愈合、无并发症。Johnston等［10］甚至认为该联合固定方法能提供可靠的稳定性及良好的骨愈合率，无需常规取出内固定物。

如图1所示，菌丝呈洁白色，较为浓密，菌丝生长由中心向外延伸；随着培养时间增长，菌落逐渐产生褐色色素，由培养初期的白色变为浅黄色至褐色，但菌落边缘仍存在较少的白色菌丝体。

图1 桦褐孔菌诱变菌株及原菌株菌落形态特征Fig.1 Colony morphological characteristics of Inonotus obliquus mutant strain and original strain

诱变菌株与同源菌株菌丝生长量比较见表2。

表2 诱变菌株与同源菌株菌丝生长情况比较Tab.2 Comparison of mycelial growth between mutant strain and homologous strain

由表2可知，紫外线照射诱变HZ1菌株菌丝体生长速度比菌株JL01略快，为2.974 mm·d-1，同时其菌丝干重相较菌株JL01增加0.058 g。

2.2 拮抗反应

拮抗反应是鉴定菌株间遗传差异的简单、便捷的方法，通过菌丝体之间相互抑制的反应以显示出菌株间不同的遗传特性，菌株间拮抗作用越明显其遗传差异越大。依据NY/T 1845-2010食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应进行试验[13]，试验结果见图2。

图2 桦褐孔菌菌株间的拮抗反应Fig.2 Antagonistic response between Inonotus obliquus strains

如图2所示，菌株HZ1与菌株JL01菌丝相接的区域均形成一条明显的沟型拮抗线，因此可以认为菌株HZ1、JL01为不同品种菌株。

2.3 ITS序列分析

通过对18S rDNA及28S rDNA的内转录间隔区与已知序列进行序列分析，ITS测序技术具有测序片段小、易于分析等特点，在真菌种属的分类鉴定研究中被广泛应用。对2株试验菌株提取DNA，以其为模板，ITS1及ITS4为引物，进行 PCR扩增获得780 bp左右的特异性扩增片段，将测序获得的ITS序列通过NCBI数据库进行在线BLAST以及利用DNA star软件对比分析。构建系统发育树，见图3。

图3 供试菌株系统发育树Fig.3 phylogenetic tree of tested strains

如图3所示，紫外诱变菌株HZ1及原菌株JL01与GenBank数据库中的桦褐孔菌株的ITS序列相似度为99%以上，证明供试菌株为桦褐孔菌。

（G+C）含量能够反映属种间的亲缘关系，其差异越小，说明菌株亲缘关系越近。2株供试菌株的（G+C） 含量见表3。

表3 供试菌株ITS序列长度及（G+C）含量Tab.3 ITS sequence length and G+C content of tested strains

如表3所示，2株供试菌株的（G+C） 含量相接近；同时通过序列对比，菌株HZ1与菌株JL01的序列相似性为99.07%，因此可以确定紫外诱变菌株HZ1为JL01同源菌株。2个菌株的碱基片段比对分析见图4。

由图4可见，桦褐孔菌原菌株JL01中部分碱基发生置换，第37个碱基对C发生颠换为G碱基对，第43个碱基对A颠换为T碱基对，第292个碱基对由C颠换为A；相较于前部分在700 bp～783 bp之间碱基突变较多，第728个碱基及第738个碱基、第776个碱基分别由G颠换为C、T颠换为G以及A转换为G，这也说明菌株HZ1为菌株JL01诱变产生。

图4 诱变菌株HZ1与原菌株JL01部分碱基序列比对Fig.4 Partial base sequence alignment between mutant strain HZ1 and original strain JL01

2.4 活性成分分析

紫外辐射处理对桦褐孔菌粗多糖含量的影响试验结果见图5。

如图5所示，紫外辐射处理后的菌株菌丝体粗多糖含量发生明显变化，与原菌株及其菌核HE粗多糖含量相比均存在显著性差异（P＜0.05）。诱变菌株HZ1菌丝体粗多糖含量远超过原菌株JL01，是原菌株含量的1.9倍，达到24.802 mg·g-1，而原菌株的粗多糖含量为12.818 mg·g-1；诱变菌株菌丝体多糖含量是原菌株菌核HE含量的1倍。原菌株JL01较其菌核HE的粗多糖含量差异并不显著，原菌株菌核HE的含量相对有所减少，为11.761 mg·g-1。

图5 桦褐孔菌诱变菌株、原菌株及菌核多糖含量Fig.5 The content of polysaccharide in mutant strain,original strain and sclerotia of Inonotus obliquus

紫外辐射处理对三萜含量的影响试验结果见图6。

如图6所示，通过对三萜含量测定分析发现，原菌株JL01三萜含量为6.309 mg·g-1，诱变菌株HZ1含量为5.630 mg·g-1，原菌株菌核HE含量为4.225 mg·g-1；诱变菌株HZ1的三萜含量略有降低，比原菌株减少0.679 mg·g-1，两者间存在显著性差异（P＜0.05）；但三萜含量高于原菌株菌核HE，原菌株JL01较其菌核HE的三萜含量高2.084 mg·g-1，存在显著性差异。

图6 桦褐孔菌诱变菌株、原菌株及菌核三萜含量Fig.6 The content of triterpenoids in mutant strain,original strain and sclerotia of Inonotus obliquus

紫外辐射处理对总多酚含量影响结果见图7。

如图7所示，通过对总多酚含量的测定分析发现，原菌株JL01的总多酚含量为14.271 mg·g-1，诱变菌株HZ1及原菌株菌核HE总多酚含量分别为17.001 mg·g-1、38.33 mg·g-1；诱变菌株 HZ1 总多酚含量高于原菌株JL01，存在显著性差异（P＜0.05），相较于原菌株JL01总多酚含量增幅为16.06%，较原菌株菌核HE低21.329 mg·g-1。

图7 桦褐孔菌诱变菌株、原菌株及菌核总多酚含量Fig.7 The content of polyphenols in mutant strain,original strain and sclerotia of Inonotus obliquus

紫外辐射处理对黄酮含量的影响试验结果见图8。

图8 桦褐孔菌诱变菌株、原菌株及菌核黄酮含量Fig.8 The content of flavonoids in mutant strain,original strain and sclerotia of Inonotus obliquus

如图8所示，通过对黄酮含量的测定分析发现，诱变菌株HZ1与原菌株JL01相比差异并不显著（P＜0.05），二者分别为 4.594 mg·g-1及 5.535 mg·g-1，但原菌株菌核HE与诱变菌株HZ1及原菌株JL01相比存在显著性差异，诱变菌株HZ1黄酮含量比原菌株菌核HE含量低70.337 mg·g-1。

紫外辐射处理对活性成分含量分布的影响试验结果见图9。

图9 桦褐孔菌诱变菌株、原菌株的活性含量分布Fig.9 Distribution of activity ingredient content in mutant strain and original strain of Inonotus obliquus

如图9所示，原菌株中总多酚含量为测定的活性成分中含量最高，其次为多糖，二者含量相差并不大；而诱变菌株中多糖含量明显升高，为测定活性成分中最高，总多酚含量次之，二者含量相差明显，分别为 24.802 mg·g-1和 17.001 mg·g-1，而黄酮及总多酚含量较低，经紫外诱变后两者含量没有明显变化，较原菌株含量有下降趋势。

2个菌株各活性成分含量的相关性分析见表4和表5。

如表4、表5所示，通过比对原菌株及诱变菌株活性成分含量相关性发现，原菌株中多糖含量与黄酮、总多酚含量呈正相关性（r1=0.491、r2=0.160），表明多糖含量的变化对黄酮含量影响不显著，黄酮含量及总多酚含量会随着多糖含量的增加而增加；多糖的含量与三萜的含量呈负相关性（r3=-0.011），表明随着总多糖含量的增加，三萜含量略微减少；黄酮含量与三萜含量、总多酚含量相比呈正相关性（r4=0.866、r5=0.939），三萜含量与总多酚含量同样也呈正相关性（r6=0.985）。诱变菌株中多糖含量与黄酮、总多酚含量呈负相关性（r7=-0.945、r8=-0.756），总多糖含量与三萜含量呈正相关性（r9=0.786）；三萜含量与黄酮、总多酚含量呈负相关性（r10=-0.945、r11=-0.189），总多酚含量与黄酮呈正相关性（r12=0.500）。

表4 原菌株JL01菌丝体活性成分含量相关性Tab.4 Correlation analysis on the content of active ingredient in the original strain JL01 mycelia

表5 诱变菌株HZ1菌丝体活性成分相关性Tab.5 Correlation analysis on the content of active ingredient in the mutant HZ1 mycelia

3 结论与讨论

在实际生产中，虽然大型真菌会发生自发性突变，但变异程度较低，同时几率较小，而通过诱变育种成功几率大幅提升。诱变育种主要是利用物理或化学诱变试剂诱导动植物体发生遗传特性变异，其中紫外线诱变育种技术是微生物育种中较为经典、便捷、广泛、效果优良、对人体健康危害较小的育种技术。通过在前期工作基础之上[14]，对桦褐孔菌活性成分进行了研究。桦褐孔菌紫外诱变菌株HZ1在性状上与JL01较为接近，通过拮抗试验及ITS序列分析比对进一步验证了诱变菌株HZ1源于原菌株JL01的事实。经紫外诱变后菌株HZ1菌丝体生长速率有明显加快，菌丝干重较原菌株增加0.058 g，同时其多糖含量显著提升2.48%，甚至高于原菌株菌核HE含量；多酚含量也明显高于原菌株；同时其三萜及黄酮含量相较于原菌株差异并不大，这也说明诱变菌株HZ1具有产量高、品质优良等特点，具有较好的开发及利用价值，为桦褐孔菌资源的研发提供新途径。

尽管如此，本试验仍存在一定局限，在栽培诱变菌株过程中发现，其菌核出现量极少，这可能是由于其突变后菌株不适宜原栽培料等原因所致。同时对比2个菌株的活性成分含量相关性发现，原株中多酚含量与黄酮含量呈正相关性，在诱变菌株中多酚与黄酮含量仍保持正相关性，但其他含量之间相关性由在原株中呈现正相关性转为负相关性（负相关性转为正相关性），这或许是由于经紫外线照射后部分碱基位点发生突变，导致其代谢途径发生改变，从而导致活性成分含量的变化，其中的具体机理还有待进一步研究。