巨大革耳子实体不同发育阶段化学成分的比较*

刘 静，李维焕，王华丽，刘 伟，吴其平，程显好**

（1.鲁东大学后勤处，山东 烟台 264025；2.鲁东大学农学院，山东省食用菌技术重点实验室，山东 烟台264025；3.山东药品食品职业学院科技处，山东 威海 264210；4.山东利农菌业有限公司，山东 东营 257442）

巨大革耳 [Panus giganteus(Berk.)Comer.]又名猪肚菇、大杯香菇、大杯伞、大漏斗菇、大杯蕈等，是一种高温菇[1]，隶属于担子菌门（Basidiomycota）担子菌纲（Basidiomycetes） 多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）革耳属（Panus Fr.）。

巨大革耳的营养成分已由部分研究报道。其蛋白质含量同香菇相近，氨基酸含量高于一般食用菌，特别是其中的异亮氨酸和亮氨酸含量突出；其子实体菌盖因蛋白质含量高且纤维素含量低，并含有 Na、Mg、Ca、K、Fe、Cu、Mn 和 Zn，以及 S、P等元素[2]，食用价值更高，而菌柄纤维化程度较高，食用价值受到影响[3-6]。戚梦等[7]的研究结果表明，巨大革耳子实体多糖是由甘露糖、葡萄糖等7种单糖组成的杂多糖，其中葡萄糖含量最多。陈睿等[8]研究认为其子实体多糖由摩尔比不同的糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成。巨大革耳子实体中还含有阿魏酸酯[9]、凝集素[10]等物质。干玉娟等[11]从巨大革耳中分离得到过氧麦角甾醇等4个化合物。其他药理试验研究表明，巨大革耳具有抗肿瘤活性[12-13]、抗氧化活性[14-16]、保肝护肝活性[17]和调节血脂等功能[18]。

在巨大革耳的生长发育过程中，子实体的不同发育阶段物质积累和化学成分含量会产生变化，目前相关研究较少。为确保巨大革耳的品质，需要明确巨大革耳子实体不同生长期化学成分的变化，以确定采收时机。

选择巨大革耳4个典型生长发育时期（棒形期、钉头期、杯形期、折卷期）的子实体，对其醇提物进行分析，探讨其小分子成分的变化规律，为巨大革耳规范化生产提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

Waters ACQUITY UPLC-Vion IMS Q-TOF超高效液相色谱-质谱联用仪、北京赛多利斯CPA225D型分析天平、Millipore超纯水仪、湖南湘仪台式高速离心机。Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，美国沃特世公司。

色谱纯甲醇/乙腈购自美国Thermo Fisher公司，色谱纯甲酸购自德国Fluka公司。

1.2 样品及处理方法

巨大革耳4个典型生长发育时期的子实体样品，从乳山市鑫宝食用菌专业合作巨大革耳栽培大棚中采集。每个时期样品采集鲜重1 000 g以上，分别编号为1号～4号。样品采集后，置于干燥箱60℃烘干至恒重。粉碎后过80目筛备用。

分别取样品1号～4号的粉末各20 mg，各加入甲醇1 mL，置于60℃温水中，超声提取60 min，以12 000 r·min-1离心5 min，取上清液进样。

1.3 定性分析色谱条件

柱温40℃，流动相A为0.1%甲酸的超纯水，流动相B为乙腈，流速为0.3 mL·min-1，梯度洗脱模式色谱分离，其程序见表1。

表1 LC/MS-Q-TOF梯度洗脱程序Tab.1 Program of gradient elution in LC/MS-Q-TOF

1.4 定性分析质谱条件

采用电喷雾离子化方式（ESI）、负离子采集方式，以MSE模式全扫描分析，离子扫描范围（m/z）为 50～1 000；采用6 eV的低能电压、20 eV～50 eV的高能电压模式；离子源温度为120℃；脱溶剂气温度为400℃；脱溶剂气流速为800 L·h-1；毛细管电压为2.5 kV。

1.5 数据分析

使用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术（UPLC/Q-TOF MSE） 模式采集数据，UNIFI软件对结果进行精确质量筛查（accurate mass screening）分析。检索文献，建立样品成分数据库，保存化合物化学结构式为.mol格式文件，导入数据库，UNIFI软件自动筛查鉴定。结合理论精确质量数、碎片离子、相对保留时间和匹配软件元素构成、质量碎片及有关文献做最终确认。

2 结果与分析

2.1 总体成分分析

采集的巨大革耳4个典型的生长发育时期的子实体样品见图1。

由图1所示，巨大革耳的子实体4个典型生长发育时期的形态有显著区别。棒形期呈保龄球状，菌伞尚未发育；钉头期呈钉子状，菌伞刚刚发育形成；杯形期的菌伞呈漏斗状或杯状；折卷期的菌伞出现了折卷、扭曲现象，各样品总离子流色谱图见图2。

图1 巨大革耳子实体不同发育阶段Fig.1 Different developmental stages of Panus giganteus fruit body

图2所示，4个不同发育时期的成分（出峰时间） 对应关系明显，分离度较好。在15 min、27 min、31 min、45 min出现的特征峰，都呈现出明显的消长规律。共鉴定出63种化学成分，氨基酸类15种、核苷酸类4种、脂肪酸类8种、糖类4种、有机酸8种、酚类10种、醌类6种、甾体类3种、其他成分5种。

图2 样品总离子流色谱图Fig.2 Sample total ion chromatogram

2.2 氨基酸类成分分析

游离氨基酸是食物呈味的物质基础之一，游离氨基酸中，谷氨酸、天门冬氨酸可以构成食物的鲜味；甘氨酸、丙氨酸和色氨酸具有甜味[19]。巨大革耳子实体氨基酸类成分色谱峰面积比较结果见表2。

由表2所示，4个发育时期中，游离氨基酸总量在棒形期、钉头期较高，这是子实体发育最快的阶段，组织代谢旺盛，表现在游离氨基酸含量更高。杯形期和折卷期游离氨基酸含量开始降低，表明子实体生理代谢的速率呈逐渐下降趋势。

表2 氨基酸类成分色谱峰面积比较Tab.2 Comparison of chromatographic peak areas of amino acid

巨大革耳子实体中，鲜味氨基酸（谷氨酸、焦谷氨酸和天门冬氨酸）含量在不同发育阶段均较高，其中谷氨酸在钉头期最高，天门冬氨酸在杯状期最高，焦谷氨酸在棒状期最高，谷氨酸和天门冬氨酸总含量在杯状期最高，到折卷期鲜味成分含量明显衰减。而甜味氨基酸（甘氨酸、丙氨酸和色氨酸）含量在4个发育时期均不高，表明氨基酸对巨大革耳的甜味贡献度不高。

游离氨基酸中含量最突出的是脯氨酸，在4个发育时期中均为含量最高的游离氨基酸，明显高于其他氨基酸几倍到几十倍。这可能与巨大革耳的耐高温出菇特性有关。研究表明，生物在胁迫条件下会发生相应的复杂应激反应，产生脯氨酸是常见应激反应之一[20]。作为一种小分子渗透保护物质，脯氨酸在抵御逆境胁迫中可以作为渗透调节剂[20]、活性氧清除剂[21]、氧化还原平衡剂[22]及蛋白质和亚细胞结构稳定剂[23-24]等。植物受到重金属胁迫[25]、碱胁迫[26]、盐胁迫[27]和高温干旱[28]等胁迫时都会积累大量脯氨酸。巨大革耳作为一种于盛夏季节出菇的高温品种，进化出耐受高温胁迫的能力，脯氨酸的大量产生可能与此相关。

与其他游离氨基酸在4个发育时期变化规律不同的是鸟氨酸，其在后2个时期含量更高，含量最高的是杯形期。L-鸟氨酸是一种非蛋白类氨基酸参与尿素代谢及生物多胺类的合成，其对人体具有治疗肝脏疾病、增强免疫力等作用，被广泛应用于医疗、保健、食品等领域[29]。

2.3 核苷酸类成分分析

4种核苷酸类成分在巨大革耳不同发育时期的含量变化情况见表3。

表3 核苷酸类成分色谱峰面积比较Tab.3 Comparison of chromatographic peak areas of nucleotide components

由表3可知，除尿苷酸外，其他3种核苷酸在最后阶段都有显著增加，可能与细胞衰老后核酸成分的自降解有关。

2.4 脂肪酸类成分分析

8种脂肪酸在巨大革耳不同发育时期的含量变化情况见表4。

由表4可知，无论是饱和脂肪酸（二十酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸）还是不饱和脂肪酸（油酸、亚油酸、亚麻酸），随着子实体的发育，都呈现累积增多的趋势。在8种脂肪酸种，油酸和亚油酸含量在4个发育时期中，远远高于其它脂肪酸含量。

表4 脂肪酸类成分色谱峰面积比较Tab.4 Comparison of chromatographic peak areas of fatty acid components

2.5 糖类成分分析

4种小分子糖类成分在巨大革耳不同发育时期的含量变化情况见表5。

表5 糖类成分色谱峰面积比较Tab.5 Comparison of chromatographic peak areas of sugar components

由表5可知，甘露糖和木糖在巨大革耳棒状期子实体中含量最高，随着子实体的发育和衰老，逐渐呈降低趋势；果糖和海藻糖含量则随着子实体的发育逐渐累积。尤其是海藻糖在子实体4个发育时期中含量均最为突出。海藻糖具有保湿和细胞保护功能，能帮助有机体对抗各种严酷环境以保持有机体的生物活性，如干燥、冰冻、高温、高渗等状态[30]。巨大革耳在其子实体中大量积累海藻糖，也是其应对高温胁迫的重要生理生化手段。

2.6 有机酸类成分分析

有机酸类在巨大革耳不同发育时期的含量变化情况见表6。

表6 有机酸类色谱峰面积比较Tab.6 Comparison of chromatographic peak areas of other organic acids

由表6可知，检测到的8种有机酸中，含量较高的是柠檬酸和苹果酸，其中柠檬酸在钉头期最高，苹果酸在杯状期最高。这2种有机酸是食品饮料中最常用的酸味调节剂，也是参与三羧酸循环中的2种有机酸，对食物的营养及风味有重要贡献[31]。

4-羟基苯甲酸有抑菌效果，另外咖啡酸、没食子酸、乌头酸，都是首次在巨大革耳子实体中检出，这几种有机酸均在子实体最后的衰老阶段积累最多，作为次生产代谢产物，和衰亡相关[32]。

2.7 酚类成分分析

多酚类成分是一类次级代谢产物，具有较强的抗氧化性，对预防心血管疾病等慢性疾病有一定的作用，并且能作为抗氧化剂广泛应用于食品、药品等众多领域[33]。多酚化合物含有多个羟基，而羟基是清除自由基的主要基团，羟基越多，清除自由基活性的能力越强[34]。大型真菌的次级代谢产物一般伴随有性生殖过程发生[35]。有机酸类在巨大革耳不同发育时期的含量变化情况见表7。

表7 酚类成分色谱峰面积比较Tab.7 Comparison of chromatographic peak areas of phenolic components

由表7可知，结果分析检测出10种多酚类产物，不同产物在4个发育时期的变化规律不同，在所检测到的10种多酚类成分中，在钉头期和杯状期检测到了所有成分，种类最全；棒形期有4种成分未检测到，折卷期有5种成分未检测到。

巨大革耳中的多酚类成分相关研究尚缺乏报道。Bai等[36]从紫色丝膜菌（Cortinarius purpuascens） 的乙酸乙酯提取物中分离到4个具DPPH自由基清除活性的聚酮类化合物rufoolivacin、rufoolivacin C、rufoolivacin D和leucorufoolivacin。试验在巨大革耳子实体中也检测到了rufoolivacin C和rufoolivacin D两种成分，rufoolivacin C随着子实体发育过程减少，而rufoolivacin D随发育过程累积。二者是否存在相互转化的关系需要进一步研究。

杨梅素可用于预防关节炎和治疗各种炎症[37]；芸香苷（芦丁） 有抗氧化、抗炎等多种生物活性[38]；原儿茶酸、儿茶素可抗菌、祛痰、平喘、抗肿瘤[39]，这些成分的分析，也为巨大革耳的生物活性研究提供了化学成分参考。

2.8 醌类成分分析

6种醌类成分在巨大革耳子实体不同发育时期的含量变化情况见表8。

由表8可知，除芥子醌外，其他5种醌类成分在最后阶段均有显著增加，特别是（3S，3’S，P） anthydrophlegmacin-9，10-quinone8’-O-methyl ether、verbindung cr11、verbindung cr60三种成分在衰老时增加明显。这些成分的变化以及生理活性研究缺乏报道，其代谢累积是否和有机体衰老相关需要进一步研究。

表8 醌类成分色谱峰面积比较Tab.8 Comparison of chromatographic peak areas of terpenoids

2.9 甾体类成分分析

3种甾体类成分在巨大革耳不同发育时期的含量变化情况见表9。

表9 甾体类成分色谱峰面积比较Tab.9 Comparison of chromatographic peak areas of steroidal components

由表9可知，除了（24R） -麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇在最后时期爆发性累积之外，另外2种成分在不同发育阶段基本保持平衡。（24R） -麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇在衰亡期显著增加，其原因需进一步探讨。

2.10 其他类成分分析

巨大革耳不同发育时期其他类成分含量变化情况见表10。

表10 其他类成分色谱峰面积比较Tab.10 Comparison of chromatographic peak areas of other components

由表10可知，脑苷脂B在巨大革耳子实体发育的杯状期含量最高，且子实体中含量丰富。脑苷脂B有重要的生物学功能，如促进细胞膜建成、胎儿大脑发育等[40]，为巨大革耳的子实体应用价值提供了理论依据。维生素C在生长发育后期含量更高，可能与抗氧化活性相关。维生素B2在发育最后阶段大量累积，也可能与细胞衰亡相关。

3 结论与讨论

采取超高效液相色谱-质谱联用方法对巨大革耳子实体不同发育阶段的成分进行分析，与其风味和营养相关的成分既有初级代谢产物，又有次级代谢产物。从含量方面分析，多在钉头期和杯型期阶段更高。而巨大革耳作为一种食品，其风味应首先考虑，也需兼顾产量和经济效益，因此采收期应为杯形期。一旦进入折卷期，机体开始衰老，有效成分迅速降低，个别次级代谢产物则大量积累，造成产品品质劣化。试验结果为巨大革耳的采收时间的确定提供了理论参考。

值得注意的是，部分企业通过品种选育，获得了专门在棒状期收获的品种，商品名为“白芦菇”[2]。棒状期并非巨大革耳适宜的收获期，但因其形态的独特性和差异性，可以在市场上实现差异化竞争，获得更好的经济效益。

巨大革耳化学成分非常复杂，此研究仅针对该次检测得到的化学成分进行比较分析，并未涉及大分子成分，如蛋白质、多糖等。这些大分子成分的变化情况有待于进一步的研究。