固相萃取技术在安神滴丸质量标准研究中的应用及思考

田介峰，罗学军，李 冉，3，李瑞明*

（1.天士力控股集团有限公司研究院现代中药开发中心，天津300410；2.天士力医药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室，天津300410；3.天津中医药大学，天津301617）

中药是在我国传统中医药理论指导下使用的药用物质及其制剂，是中华民族的瑰宝，但是由于其化学成分复杂，质量控制一直是中药面临的难题之一。当前中药质量控制主要是针对其中一种或者几种有效成分或特征性成分，在此基础上刘昌孝院士等人提出了中药质量标志物的概念（quality marker，Qmarkers），将与中药的有效性和安全性有关的中药成分作为中药质量控制的质量标志物［1］，但是由于中药化学成分复杂，在对质量标志物进行定性鉴别或定量测定时往往会受到其他成分的干扰，因此中药质量标准中的供试品前处理方法显得尤为重要。良好的供试品前处理方法不仅节约检验时间，减少有机试剂的使用量，还能提高检测方法的专属性和重现性，使方法开发及样品检验达到事半功倍的效果。

对于大多数中药样品的前处理都需要经过较为复杂的提取及富集过程。提取方法主要包括超声，热回流及索氏提取等；富集方法主要是液-液萃取法，但液-液萃取法具有很多缺点如：萃取过程中极易发生乳化导致操作困难；萃取过程用到大量有机试剂；难以自动化等。固相萃取技术是20世纪70年代发展起来的一种样品预处理分离富集技术［2］，很好地克服了液-液萃取的各种缺点。固相萃取技术实质上也是一种色谱分离的手段，原理和液相色谱类似，由于其固定相（填料）及流动相可以根据目标化合物的性质使用不同性质的材料和试剂，因此固相萃取技术广泛应用于分析化学、制药工业分析、临床医学分析、食品分析、烟草工业分析、环保分析等多个领域［3-8］。近年来，一些新的固相萃取填料和技术也得到了应用，如分散固相萃取（dispersive solid phase extraction）［9］，分子印迹聚合物固相萃取［10］等。

安神滴丸是天士力医药集团股份有限公司研发的中药新药，具有养血活血，益气安神等功效，目前处于Ⅱ期临床阶段。由炒酸枣仁、合欢花、三七叶和甘草四味药组成。通过文献调研［11-13］及前期试验将酸枣仁皂苷A、B，槲皮苷，人参皂苷Rb1、Rb3作为安神滴丸质控的质量标志物，其中酸枣仁皂苷A、B，槲皮苷，人参皂苷Rb1、Rb3作为TLC鉴别的质量标志物，人参皂苷Rb3作为含量测定的质量标志物。本文通过C18固相萃取小柱进行样品前处理，开发安神滴丸的质量标准获得了良好的效果，特别是TLC鉴别的供试品溶液制备，通过固相萃取梯度洗脱一次可以得到3个供试品溶液。近年来中药质量控制愈发全面、科学，对于包含多味药的大复方需要使用多个质量标志物进行质量控制，中药质量标准开发及检验成本会大幅提升，因此一次样品前处理获得多个供试品溶液的思路显得尤为重要。

1 仪器与试剂

1.1 仪器ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（沃特世公司）；ST16R高速离心机（Thermo Scientific）；KQ 500DE超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司）；XS205DU电子分析天平（梅特勒托利多公司）；手动固相萃取仪（沃特世公司）；Milli Q Advantage超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药 固相萃取小柱（ProElut C18，1 000 mg/6 ml，DIKMA公司）；固相萃取小柱（Cleanert S C18-N，1 000 mg/6 ml，Agela公司）；安神滴丸（批号20190402，天士力医药集团股份有限公司）；色谱纯乙腈（批号JA088630，Merck公司）；其余试剂均为市售分析纯试剂；硅胶G板（批号20190710，青岛海洋化工厂分厂）；聚酰胺薄膜（批号20190903，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；酸枣仁皂苷A对照品（批号110734-201914，含量以96.0%计，中国食品药品检定研究院）；酸枣仁皂苷B对照品（批号110814-201809，含量以96.2%计，中国食品药品检定研究院）；槲皮苷对照品（批号111538-20160，含量以90.6%计，中国食品药品检定研究院）；人参皂苷Rb1对照品（批号110704-202028，含量以93.1%计，中国食品药品检定研究院）；人参皂苷Rb3对照品（批号111686-201504，含量以97.0%计，中国食品药品检定研究院）；甘草酸铵对照品（批号110731-201720，含量以97.7%计，中国食品药品检定研究院）。

2 方法与结果

2.1 全方化学成分分析 通过对全方化学成分分析，了解质量标志物的极性，为固相萃取的方法开发提供依据。

2.1.1 供试品溶液制备 称取安神滴丸1 g，加入60%乙醇10 ml超声30 min使溶解（均匀分散，无块状物），提取液（5 000 r/min）离心10 min，倾出上清液，过滤，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取适量酸枣仁皂苷A、B，槲皮苷，人参皂苷Rb1、Rb3和甘草酸铵置于量瓶中，加甲醇溶解，配置成1 ml各含0.5 mg的对照品溶液，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～3 min，10%乙腈；3～5 min，10%→15%乙腈；5～8 min，15%→20%乙腈；8～10 min，20%→25%乙腈；10～12 min，25%→30%乙腈；12～14 min，30%→35%乙腈；14～20 min，35%→45%乙腈；20～25 min，45%→75%乙腈；25～30 min，75%→90%乙腈；30～35min，90%→100%乙腈；进样量4 μl；流速0.3 ml/min；柱温30℃；选择全波长扫描。

2.1.4 结果 通过对照品比对以及色谱峰紫外吸收分析，可将安神滴丸全方化学成分分析色谱图依据色谱峰保留时间分为4个区域（图1），0~6 min为大极性化学成分区，6~14 min是以黄酮苷为主的中大极性化学成分区，其中槲皮苷的含量最大，14~20 min是以三萜皂苷为主的中小极性化学成分区（主要成分为人参皂苷Rb1、Rb3，酸枣仁皂苷A、B，甘草酸等），20~35 min为小极性化学成分区［其中包括三萜类化合物如甘草次酸（甘草次酸为甘草酸的苷元）等］。结果显示安神滴丸的化学成分在反相色谱中按化学成分的极性大小有较好的分离效果，质量标志物也分布在不同的极性区域内，提示可以通过使用反向填料（C18）的固相萃取小柱对安神滴丸进行前处理，通过梯度洗脱一次得到多个供试品溶液。

图1 安神滴丸和对照品色谱图

2.2 TLC鉴别 依据安神滴丸全方化学成分分析的结果进行了固相萃取小柱洗脱条件的探索，最终将鉴别项供试品溶液制备方法确定如下：取安神滴丸0.5 g，压破包衣，加入60%乙醇5 ml超声30 min使溶解（均匀分散，无块状物），提取液离心（5 000 r/min）10 min，倾出上清液，在上清液中加入5 ml水，混匀后上样到C18固相萃取小柱［1 g/6 ml，固相萃取小柱需提前依次使用甲醇（10 ml）和水（10 ml）处理活化，上样流速为1 ml/min。上样完成后先用水（20 ml）进行洗脱（除去大极性化学成分），弃去洗脱液后依次使用40%甲醇（20 ml）、60%甲醇（20 ml）和80%甲醇（20 ml）进行梯度洗脱，洗脱流速均为1 ml/min。将40%甲醇洗脱液、60%甲醇洗脱液和80%甲醇洗脱液分别蒸干，再分别用2 ml甲醇溶解作为合欢花（槲皮苷），炒酸枣仁（酸枣仁皂苷A、B），三七叶（人参皂苷Rb1、Rb3）鉴别项的供试品溶液。通过对各鉴别项的色谱条件开发及专属性、耐用性的考查（图2-4），最终确定了各薄层鉴别项色谱条件。合欢花薄层鉴别项色谱条件：固定相：聚酰胺薄膜；展开剂：80%甲醇/水；显色剂：3%FeCl3乙醇溶液；炒酸枣仁薄层鉴别项色谱条件：固定相：硅胶G板；展开剂：水饱和正丁醇-甲醇（10∶1）；显色剂：2%香草醛-10%硫酸乙醇溶液，60℃显色；三七叶薄层鉴别项色谱条件：固定相：硅胶G板；展开剂：氯仿-甲醇-水（7∶3∶0.5）；显色剂：2%香草醛-10%硫酸乙醇溶液，80℃显色。试验结果表明所开发方法的专属性（和阴性样品比较）及耐用性（使用不同厂家的SPE小柱进行样品前处理）较好且省时、省力，极大得缩短了检验时间并降低了检验成本。

图2 合欢花薄层色谱图

2.3 含量测定

2.3.1 供试品溶液制备 依据安神滴丸全方化学成分分析的结果进行了固相萃取小柱洗脱条件的探索，最终将人参皂苷Rb3含量测定供试品溶液制备方法确定如下：称取安神滴丸约2 g，精密称定，压破包衣，加入60%乙醇10 ml超声30 min使溶解（均匀分散，无块状物），提取液离心（5 000 r/min）10 min，倾出上清液，在离心管中加入10 ml 60%乙醇，超声洗涤残渣后离心（5 000 r/min）10 min，倾出上清液，合并两次上清液。在上清液中加入20 ml水（稀释1倍），混匀后上样到SPE固相萃取小柱［1 g/6 ml，SPE固相萃取小柱需提前依次使用甲醇（10 ml）和水（10 ml）处理活化］，上样流速为1 ml/min。上样完成后先用水（20 ml）进行洗脱，弃去洗脱液后依次使用40%甲醇（20 ml）、甲醇（10 ml）进行梯度洗脱，洗脱流速均为1 ml/min。使用10 ml量瓶收集甲醇洗脱液，定容，摇匀，过滤，即得。

2.3.2 对照品溶液制备 称取适量人参皂苷Rb3对照品，精密称定，用60%乙醇配制成浓度约为0.5 mg/ml的对照品溶液。

2.3.3 色谱条件与系统适用性 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～10 min，25%乙腈；10～11 min，25%→28%乙腈；11～30 min，28%乙腈；30～31 min，28%→90%乙腈；31～35 min，90%乙腈；35～36 min，90%→25%乙腈；36～40 min，25%乙腈；进样量2 μl；流速0.5 ml/min；柱温30℃；检测波长203 nm。理论板数按人参皂苷Rb3色谱峰计算应不低于8 000；进样量2 μl。

图3 炒酸枣仁薄层色谱图

图4 三七叶薄层色谱图

2.3.4 精密度试验 取“2.3.2”项下人参皂苷Rb3对照品溶液按“2.3.3”项下色谱条件连续进样6次。结果，峰面积的RSD为0.30%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 专属性试验 取60%乙醇（空白溶剂）、空白溶液（不上样其余制备过程同供试品溶液）、阴性样品溶液（制备方法同供试品溶液）、人参皂苷Rb3对照品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样记录色谱图，结果显示取60%乙醇、空白溶液及阴性样品溶液在人参皂苷Rb3色谱峰处无干扰，表明方法专属性良好。见图5。

图5 空白溶剂（A）

2.3.6 线性试验 精密称取50 mg人参皂苷Rb3用60%乙醇溶解，置于25 ml量瓶中，定容，摇匀即得浓度为2 mg/ml的对照品母液。稀释后分别得浓度为1、0.5、0.4、0.25和0.2 mg/ml的对照品溶液。分别精密吸取6种浓度的对照品溶液各2 μl注入超高效液相色谱仪，按“2.3.3”项下的色谱条件进行分析，记录峰面积，用最小二乘法进行线性回归，计算线性方程和相关系数。试验表明人参皂苷Rb3浓度在0.20~1.96 mg/ml范围内响应值与其浓度呈良好的线性关系，回归方程为Y=942 516 X-467.91（r=1.000 0）。

2.3.7 重复性试验 取批号为20190402的供试品6份，按“2.3.1”项下的方法制备供试品溶液，检测人参皂苷Rb3含量，结果6份供试品溶液的人参皂苷Rb3含量平均值为2.19 mg/g，RSD为1.3%。

2.3.8 准确度试验 取批号为20190402的供试品6份每份约1 g，精密称定，分别加入线性项下浓度为2 mg/ml的对照品溶液1 ml（对照品加入量和供试品中待测定成分量约为1∶1），加入60%乙醇补足至10 ml，然后按“2.3.1”项下的供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液。按“2.3.3”项下的色谱条件进行分析，记录峰面积，计算加样回收率，考查方法的准确度。6份加样回收样品的回收率平均值为102.7%，RSD为2.3%。

2.3.9 溶液稳定性试验 将供试品溶液及对照品溶液分别于室温下放置0、6、12、18和24 h时进行检测，记录峰面积。结果显示供试品溶液中人参皂苷Rb3色谱峰面积的RSD%为1.4%，对照品溶液中人参皂苷Rb3色谱峰面积的RSD%为1.1%，表明供试品溶液及对照品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

3 讨论

结合全方化学成分分析结果，槲皮苷极性较大，在反向色谱中出峰较早，试验表明40%甲醇溶液即可将其洗脱。酸枣仁皂苷A、B极性较小，可用60%甲醇进行洗脱。人参皂苷Rb1、Rb3极性也较小，试验表明其色谱行为与酸枣仁皂苷A、B接近，在60%甲醇洗脱时会有少量人参皂苷Rb1、Rb3泄露，但主要成分还是酸枣仁皂苷A、B，80%甲醇洗脱时会有大量人参皂苷Rb1、Rb3流出。因此将40%、60%和80%甲醇溶液分别作为合欢花、炒酸枣仁、三七叶鉴别项的供试品溶液。可见固相萃取技术很好的分离、富集了不同成分，使其分析的专属性、灵敏度大幅度提升，成功地应用于安神滴丸鉴别及含量测定的样品前处理，开发了省时、省力且专属性、重现性等均较好的分析方法，极大地节省了检测时间，提高了检测效率，为中药新药开发中质量标准研究提供了新思路。

固相萃取技术是一种具有很多优势的样品前处理技术，特别适用于化学成分复杂的中药的样品前处理，目前已有多种填料及型号的市售固相萃取小柱可供选择，但2020版《中国药典》［14］中收录的药材及制剂（2 711种）中仅有少量品种（32种）用到了固相萃取技术（《中国药典》中某些品种的样品前处理用到了D101等大孔吸附树脂，严格意义上讲也属于固相萃取技术的应用，但在实际操作过程中由于手动填装的开放柱影响因素较多，方法的重现性会受到一定影响，也不利于后期的自动化，和当前主流的固相萃取技术差别较大，故不做统计），其中7个品种还是2020版新收录品种。其原因可能是以下两个方面：首先可能是《中国药典》收录的是使用历史较长且成熟的品种，这些品种的质量标准开发时固相萃取技术还不成熟。新版《中国药典》中新收录的品种中使用固相萃取进行样品前处理的品种比例升高也佐证了这一原因；其次可能是出于成本考虑，市售的固相萃取小柱价格较高，特别是一些填料价格本身较贵（如C18等）的固相萃取小柱，但是由于这些固相萃取小柱一般经过简单处理可以反复使用并且所需样品及试剂量少，以及可以通过一次样品前处理获得多个供试品溶液等，综合成本核算往往低于传统的液-液萃取，且可以避免使用大量对环境及人体有毒有害的有机试剂。随着《中国药典》倡导的“扩大成熟分析技术应用”，固相萃取技术必将越来越多的应用于分析样品的前处理中。