实时荧光定量PCR 用于新型冠状病毒检测的效果分析

袁红福

(甘肃省金昌市疾病预防控制中心，甘肃 金昌 737100)

自2019 年12 月开始，湖北武汉及我国其他地区相继爆发一种以发热、乏力、干咳为主要症状的呼吸系统疾病，后通过实验室分离鉴定，确定病原体是一种新冠病毒。新冠病毒感染所致的肺炎即新冠肺炎在各年龄段普遍易感，传播途径主要是经飞沫及密切接触传播。2020 年1 月30 日发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗快速建议指南(标准版)》指出[1]，呼吸道或血液标本实时荧光定量聚合酶链反 应（quantitative Real -time polymerase chain reaction，qPCR）检测新冠病毒或病毒基因测序与已知的新冠病毒高度同源两者满足其一便可确诊病例。病原学检测为确诊新冠病毒的金标准，但其检验周期长，步骤繁琐，且对检测人员的技术要求相对较高，故使得qPCR 的核酸检测成为现阶段新冠肺炎诊断中最为广泛应用的一种手段[2]。本研究将qPCR 应用于疾控中心新冠病毒检测中的情况汇报如下。

1 材料

1.1 标本来源

采集筛查2020 年2 月至6 月疫情期间有发热症状、有湖北工作、旅居史者的咽拭子标本15650份，其中男性9359 例，女性6291 例；年龄7～79 岁，平均（48.31±8.09）岁。

1.2 试剂与仪器

核酸提取仪采用江苏硕世Smart64 核酸提取仪和西安天隆Smart32 核酸提取仪。扩增仪采用安捷伦Mx3000 P 型和赛默飞ABI Q5 型PCR 仪。

1.3 方法

1.3.1 采样

采集受检者咽拭子样本，通过使用植绒拭子于咽峡深部反复刮取得到。采样成功后，将咽拭子置于细胞保存液并及时送往实验室检测。因采集样本质量与核酸检测结果直接相关，故应确保采集操作准确，如把握采集力度、采集部位正确等。

1.3.2 核酸提取及qPCR 扩增反应

通过使用磁珠法对核酸进行提取，所用仪器为西安天隆基因的Smart32 核酸提取仪和江苏硕士基因的Smart64 核酸提取仪，试剂盒包含裂解液、蛋白酶K 溶液、磁珠分散液、洗涤液、洗脱液。应用qPCR检测试剂盒进行qPCR，相关操作均严格依照试剂盒说明书开展，每种病毒的qPCR 体系均使用PCR反应液20μL（包含A17μL、B3μL）及核酸提取液5μL。中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所的官网于2020 年1 月21 日发布自行设计的新冠病毒核酸检测引物和荧光探针序列，其第一对、第二对引物与探针分别针对ORF1ab 及N 基因所设计，详见表1。用ABIQ5 型，MXX3000PPCR 仪对新冠病毒进行qPCR 核酸检测，扩增反应参数：50℃15 min，95℃15min，1 个循环；94℃15s，55℃45s，40 个循环。

表1 新型冠状病毒核酸检测引物与探针序列

1.3.3 结果判定

实验要设置一个阴性质控及一个阳性质控。用ABIQ5 型，安捷伦Mx3000P 型qPCR 仪及自配的软件来绘制标准曲线并做分析。如无Ct 值或Ct 值在40 以上则判定为阴性；如Ct 值在37 以下则判定为阳性；如Ct 值为37～40，则建议再做一次实验，如实验结果Ct 值在40 以下，且扩增曲线起峰明显，则判定为阳性，反之判定为阴性[3]。

1.3.4 实验室安全监管

正确使用防护服、KN95 防护口罩、护目镜、防护手套、鞋套等安全防护用品，并按照国家标准要求对核酸检测实验室的检测工作流程进行制定，并对实验室进行合理的功能分区。实验室内的垃圾一律视为传染性垃圾，用双层黄色医疗垃圾袋密闭包装后带出实验室，并交给专人予以高压灭菌等处理。

1.4 统计学方法

应用SPSS20.0 软件处理数据，计数资料用百分率（%）表示。

2 结果

15650份检测标本中，阳性1例，阳性率0.0064%。

3 讨论

人体在受到新冠病毒感染后一般会出现发热、干咳、乏力等症状，部分重症患者可出现脓毒症休克、代谢性酸中毒、多器官功能衰竭等，可致其生命受到极大威胁。因此，应及早发现新冠肺炎进行隔离治疗，使患者获得理想预后，阻断病毒的大范围传播。qPCR 是一种具有超灵敏度、超特异性、成本低等优势的核酸检测技术，在新冠肺炎诊断中应用频度较高[4]。本研究利用qPCR 方法筛查有湖北工作、旅居史者，以及羁押人员、住院病人、海鲜产品销售等有关人员咽拭子标本进行检测，发现新冠病毒核酸检测阳性率为0.0064%。

自我国对外公布新冠病毒的基因组序列数据后，一些公司竞相研发对新冠病毒基因组实现有效检测的qPCR 体系。qPCR 体系关键在于设计出灵敏度高、特异性强的引物与探针序列，既实现对新冠病毒基因组序列的高效扩增，又将新冠病毒基因组同229E、OC43、NC63 等既往流行的冠状病毒与流感病毒的基因组有效区分开[5-6]。香港大学与北京疾病预防控制中心针对新冠病毒建立了qPCR 体系，其2 套引物与探针分别针对新冠病毒的ORF1ab 及N 基因所设计。qPCR 体系检测灵敏度较强，可检测出拷贝数低至10 的DNA 分子。利用此体系检测1例新冠病毒感染者的咽拭子标本，结果呈阳性。而其他常见冠状病毒的采集标本进行检测时，结果呈阴性，提示特异性较好[7]。

现阶段，已有多家企业生产新冠病毒核酸检测试剂盒。尽管基于qPCR 体系的核酸检测试剂盒的使用原理大致相似，但其性能存在一定差别。如某研究小组采集1 例弱阳性患者咽拭子标本，利用6种国产核酸检测试剂盒开展平行检测，结果显示[8]，仅有2 种试剂盒可同时扩增ORF1ab、N 基因等2段基因序列，而其余几家核酸检测试剂盒仅能扩增1 段基因序列。且6 家试剂盒批内重复检测的结果不相同，变异系数最差为0.23，最佳为5.84。伴随病情发展，仅有3 家试剂盒能定量反映出病毒拷贝数的增加。提示各家核酸检测试剂盒的检测能力仍有进步上升的空间。另外，为尽可能减少假阴性、假阳性结果的出现，需做到如下几点：（1）安排技术水平高的人员进行新冠病毒检测，同时应改进标本采集的手段及其运输条件等，分析病情所处的阶段[9]；（2）尽量选择获得国家药械注册证的试剂盒，在使用早期，不宜盲目信任一家生产的试剂盒，而将其他家生产的试剂盒全盘否认，而是应综合考量[10]。

综上所述，基于qPCR 的核酸检测在新冠肺炎诊断中起着重要作用，可有效准确检测出咽拭子标本中的新冠病毒核酸，对于检疫防疫工作的开展大有助益。