添加纤维素酶和淀粉对象草青贮发酵品质的影响

李 莉 吴汉葵 解祥学* 赵国强 何家俊 胡志超 杨昕涧 吴 浩

(1.广东溢多利生物科技股份有限公司，珠海 519060；2.广东燕塘乳业股份有限公司，广州 510000；3.中国农业大学动物科技学院，北京 100193)

象草原产于非洲、亚洲南部和澳大利亚等地，是热带、亚热带地区普遍栽培的多年生高产暖季型牧草，现今在我国南方各省大面积种植利用[1]。由于象草产量高、生长速度快，并且夏季剩余较多，而南方地区多雨、潮湿，难以进行干草调制，青贮得到广泛应用。但是象草水溶性碳水化合物含量低，粗纤维素含量高，且表现为多茎、茎空、粗硬的物理结构，青贮过程中不易压实，有较多的空气包含其中，容易造成呼吸作用及好氧性微生物活动时间延长，使乳酸菌发酵底物不足，青贮难以获得成功[2-4]。因此，在象草青贮过程中经常使用添加剂进行发酵。

纤维素酶能够把饲料中的纤维素降解成为可消化吸收的还原糖，提升饲料的营养价值，是一种绿色饲料添加剂[5]。现今，纤维素酶在反刍动物生产应用中取得了良好的生产效益和经济效益。象草中的碳水化合物含量比较低，在青贮发酵时不能为乳酸菌繁殖提供足够的营养物质，导致发酵品质变坏[6]。青贮过程中添加淀粉可增加发酵底物，加速青贮饲料的发酵进程。

目前对象草饲料化利用的研究较少，对添加纤维素酶对象草青贮发酵品质影响的研究报道有限，对添加纤维素酶和淀粉对象草青贮发酵品质和微生物多样性影响的研究更是未见报道。因此，本试验以象草为研究对象，探究在象草青贮过程中添加纤维素酶和淀粉对象草青贮发酵品质和微生物多样性的影响，为合理青贮象草提供数据支持和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将种植于广东溢多利溢园牧场试验地完熟期的象草于2020年4月18日刈割，用铡草机切成2～3 cm长，茎叶充分混合均匀后即为青贮原料。象草青贮前的化学成分见表1。

表1 象草青贮前化学成分Table 1 Chemical composition of napier grassbefore ensiling

1.2 试验设计

试验采用完全随机设计，设置3个组，分别为对照组、添加纤维素酶组(纤维素酶制剂添加量为0.05%，试验Ⅰ组)，混合添加纤维素酶与淀粉组(纤维素酶制剂添加量为0.05%，淀粉添加量为2%，试验Ⅱ组)。各添加剂的添加量均为鲜重基础，纤维素酶制剂中纤维素酶活性为120 000 U/g。各组青贮原料在室温[(24±2) ℃]条件下贮藏，在发酵第30天结束后打开小型青贮窖取样进行分析，每组贮藏3袋作为3个重复，共9袋。

1.3 试验方法

1.3.1 象草青贮饲料的制作

将全株象草切成2～3 cm后称取100 g，快速装填并压实，于110 mL的小型青贮窖中密封后，置于室温条件下保存，在青贮发酵第30天打开，取样进行分析。

1.3.2 样品预处理

青贮窖打开后，取出全部青贮饲料混匀，称取10 g用来测定微生物(乳酸菌、酵母菌、霉菌)数量。另外称取25 g放入300 mL的广口三角瓶，加入225 mL的蒸馏水，充分搅拌后密封，在4 ℃的冰箱内浸提24 h，期间振荡摇匀数次。然后用过滤漏斗通过2层纱布和滤纸过滤，保存滤液(-20 ℃冷冻保存)待测。滤液用来测定pH以及乳酸、氨态氮和挥发性脂肪酸浓度。将剩余的部分青贮饲料收集起来烘干，称重粉碎，测定干物质、总氮、粗脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维以及水溶性碳水化合物含量。部分剩余的、未烘干青贮饲料装入无菌的50 mL冻存试管中，保存于-20 ℃冰箱中，用于测定青贮饲料中微生物多样性。

1.4 测定方法

1.4.1 营养成分含量和发酵品质指标测定

干物质含量采用将青贮饲料放置于105 ℃的烘箱中烘2 h，然后将烘箱调至65 ℃的恒温继续烘直至恒重的方法[7]测定；总氮含量通过凯氏定氮法[8]测定；粗脂肪含量采用索氏抽提法测定；参照Van Soest等[9]的方法，使用纤维分析仪(ANKOM A200i，北京安科博瑞科技有限公司)测定中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。采用pHS-3C精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)对青贮饲料样品处理后的过滤液直接测定pH；采用苯酚-次氯酸钠比色法[10]和硫酸-蒽酮比色法[11]分别测定氨态氮和水溶性碳水化合物含量；参照Cao等[12]的方法，使用LC-100高效液相色谱仪测定乳酸、挥发性脂肪酸含量；采用弗氏评分法[13]对青贮饲料发酵品质等级进行评定。

1.4.2 微生物数量分析

采用平板计数法对象草青贮中乳酸菌、酵母菌、霉菌进行计数[13]。将待测样品稀释适当倍数后产生计数菌落，并用每克鲜重中菌落形成单位的对数[lg(CFU/g FM)]表示菌落数。取10 g青贮饲料置于装有90 mL无菌蒸馏水的容量瓶中，充分混匀，并进行连续梯度稀释。每份浸提液取1 mL，滴加到提前预备的培养基上。乳酸菌使用MRS Agar培养基(青岛海博生物科技有限公司)，置于厌氧培养箱(37 ℃)培养48 h，计数菌落数。酵母菌和霉菌使用Potato Dextrose Agar培养基(通过菌落外观和细胞形态区分酵母菌与霉菌)置于恒温培养箱(30 ℃)培养48 h，计数菌落数。

1.4.3 微生物多样性分析

使用试剂盒提取象草青贮中的微生物组总DNA，利用前引物和后引物获得细菌16S rRNA基因V3～V4高变异区。扩增产物回收纯化，基于Illumina NovaSeq测序平台对该文库进行双末端测序[14]。Illumina NovaSeq测序及结果分析均由北京诺禾致源生物科技股份有限公司协助完成。

1.5 数据统计与分析

数据先用Excel 2007软件进行初步统计整理，再用SAS 9.2软件对各不同指标的数据进行统计分析。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。利用Novomagic在线平台分析微生物相对丰度，并进行操作分类单元(OTU)分析、alpha多样性分析、主成分分析(PCA)、物种组成分析等。

2 结果与分析

2.1 添加纤维素酶和淀粉对象草青贮营养成分含量的影响

由表2可知，象草青贮第30天，各组间干物质和粗蛋白质含量差异不显著(P>0.05)。试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的水溶性碳水化合物含量均高于对照组，比对照组分别提高了37.95%(P>0.05)、106.10%(P<0.01)，且试验试验Ⅱ组还极显著高于试验Ⅰ组(P<0.01)。试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量均低于对照组，且试验Ⅱ组显著低于对照组(P<0.05)。

表2 添加纤维素酶和淀粉对象草青贮营养成分含量的影响Table 2 Effects of adding cellulase and starch on nutrient contents of napier grass silage

2.2 添加纤维素酶和淀粉对象草青贮发酵品质的影响

由表3可知，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的pH均极显著低于对照组(P<0.01)，2个试验组之间差异不显著(P>0.05)。试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的乳酸、乙酸含量高于对照组，同时试验Ⅱ组的乳酸、乙酸含量高于试验Ⅰ组，但各组之间差异不显著(P>0.05)。所有样品均未检测出丁酸。试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的乳酸/乙酸值比对照组分别提高了23.42%、37.59%，但各组之间差异不显著(P>0.05)。各组间的氨态氮/总氮值差异不显著(P>0.05)。试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的弗氏评分显著高于对照组(P<0.05)，对照组的等级为尚可，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的等级为良好。

表3 添加纤维素酶和淀粉对象草青贮发酵品质的影响Table 3 Effects of adding cellulase and starch on fermentation quality of napier grass silage

2.3 添加纤维素酶和淀粉对象草青贮微生物数量的影响

由表4可知，象草青贮第30天，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的乳酸菌数量比对照组分别提高了2.39%、3.27%，但各组之间差异不显著(P>0.05)。所有样品均未检出酵母菌和霉菌。

表4 添加纤维素酶和淀粉对象草青贮微生物数量的影响Table 4 Effects of adding cellulase and starch on microbial population of napier grass silage lg(CFU/g FM)

2.4 添加纤维素酶和淀粉对象草青贮微生物多样性的影响

2.4.1 象草青贮细菌OTU基础分析结果

由图1可知，3个组象草青贮细菌共有的OTU数为58个，对照组特有OTU数为29个，试验Ⅰ组特有OTU数为27个，试验Ⅱ组特有OTU数为52个。对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的象草青贮细菌OTU数分别为203、201和226个。

图1 象草青贮细菌OTU分布Venn图Fig.1 Venn diagram of bacterial OTU distribution of napier grass silage

2.4.2 象草青贮微生物alpha多样性分析结果

表5中数据为象草青贮开封后的微生物alpha多样性指数。覆盖度用于表示本次测序相对于整体样本的覆盖程度，数值越高，覆盖程度越高。所有组的覆盖度均大于0.999，说明测序深度基本全面覆盖微生物的核心组成。总体来看，试验Ⅱ组的Chao1指数、ACE指数均高于对照组和试验Ⅰ组，说明试验Ⅱ组与对照组、试验Ⅰ组相比，样本菌群丰度较高，多样性水平也相对较高。试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的Shannon指数、Simpson指数均高于对照组。

表5 象草青贮微生物alpha多样性指数Table 5 Microbial alpha diversity indexes of napier grass silage

2.4.3 象草青贮微生物群落PCA结果

基于OTU水平的PCA结果见图2。2个点之间的距离越近，表明这个2个样本之间的微生物群落结构相似度越高。由图可知，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)对结果差异的贡献度分别为34.15%、24.39%。不同组的青贮样品能够较明显的区分开，说明不同组青贮样品中微生物群落的组成存在一定的差异。

图2 PCA的三维排序图Fig.2 3D sorting chart of PCA

2.4.4 基于门水平的微生物群落结构分析结果

图3显示了在门水平上象草青贮微生物菌群结构的变化，其他菌门中包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、栖热链球菌门(Deinococcus-Thermus)和软皮菌门(Tenericutes)等。其中，占绝对优势的厚壁菌门的相对丰度由高到低的顺序为试验Ⅱ组>试验Ⅰ组>对照组。除厚壁菌门外，对照组和试验Ⅱ组的优势菌门为蓝菌门(Cyanobacteria)，试验Ⅰ组为变形菌门(Proteobacteria)。

Firmicutes：厚壁菌门；Cyanobacteria：蓝菌门；Proteobacteria：变形菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Tenericutes：软皮菌门；Actinobacteria：放线菌门；Verrucomicrobia：疣微菌门；Gemmatimonadetes：芽单胞菌门；Deinococcus-Thermus：栖热链球菌门；Chloroflexl：绿弯菌门；Others：其他。

2.4.5 基于属水平的微生物群落结构分析结果

图4显示了在属水平上象草青贮微生物菌群结构的变化，各组占绝对优势地位的菌属均为乳杆菌属。除乳杆菌属外，对照组的优势菌属为未分类的蓝细菌属，其次为乳球菌属；试验Ⅰ组的优势菌属为未分类的蓝细菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属和泛生菌属；试验Ⅱ组的优势菌属依次为未分类的蓝细菌属、乳球菌属和魏斯氏菌属。

Lactobacillus：乳杆菌属；Unclassified-Cyanobacteria：未分类的蓝细菌门；Lactococcus：乳球菌属；Weissella：魏斯氏菌属；Pantoea:泛生菌属；Acinetobacter：不动杆菌属；Citrobacter:柠檬酸杆菌属；Pedlococcus：戊酸乳球菌属；Serratia:沙雷氏菌属；Enterococcus：肠球菌属；Others：其他。

3 讨 论

3.1 添加纤维素酶和淀粉对象草青贮营养成分含量的影响

在青贮发酵过程中，各组的干物质损失比较少，干物质含量差异不显著。这主要是由于本试验采用小型青贮窖模拟生产实践，青贮窖快速密封，且密封效果好，青贮象草无流汁损失。有研究表明，可溶性碳水化合物含量会影响乳酸菌发酵速度，过低将减慢乳酸菌发酵进程，不能够及时降低青贮pH和有效抑制有害微生物的活动[15]。贾燕霞等[1]试验发现，随着酶添加量的增加，水溶性碳水化合物含量增加。Jones[16]添加淀粉到黑麦草青贮中，发现青贮饲料的水溶性碳水化合物含量提高3%～4%，提高了青贮饲料的发酵品质。本试验中，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的水溶性碳水化合物含量均高于对照组，且试验Ⅱ组的水溶性碳水化合物含量极显著高于对照组和试验Ⅰ组，青贮质量得到提高。

中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量降低可以认为在青贮过程中分解了部分纤维素、半纤维素，释放出一定的水溶性碳水化合物，能够给乳酸菌提供更多的发酵底物，提高青贮饲料的发酵品质[17]。国内学者研究表明，纤维素酶能降低青贮饲料的中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维含量，提高青贮质量[18-19]。本试验中，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量均低于对照组，且试验Ⅱ组显著低于对照组。这说明试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的青贮质量都得到提高，且试验Ⅱ组的青贮质量较好。

3.2 添加纤维素酶和淀粉对象草青贮发酵品质的影响

pH是评判青贮发酵品质的指标之一，反映了总酸的含量[20]。品质优良的青贮饲料的pH在3.8～4.2[21]。当青贮饲料品质较优时，它的值越小，其酸度就越高，营养物质损失就越少[22]。周昕等[23]在食叶草青贮中添加糖蜜，使得pH低于对照组；朱旺生等[24]研究表明，皇竹草青贮中添加纤维素酶能有效地降低pH。本试验中，虽然所有组pH都较高，但试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的pH均极显著低于对照组。

乳酸和挥发性脂肪酸含量是评价青贮质量好坏的重要指标[25]。据Catchpoole等[26]报道，品质优良的青贮饲料的乳酸含量介于30～130 g/kg DM。研究表明，纤维素酶能显著提高大黍青贮的乳酸含量[19-20]。周昕等[22]研究表明，在食叶草青贮中添加糖蜜可增加发酵底物，促进乳酸发酵。乙酸主要是由异质型乳酸菌产生，具有较强的抗真菌能力[27]。Alli等[28]研究显示，与对照组相比，添加糖蜜的苜蓿青贮pH较低、乳酸和乙酸含量高，青贮品质较好。本试验中，乳酸、乙酸、乳酸/乙酸值由高到低的顺序为试验Ⅱ组>试验Ⅰ组>对照组，与上述试验结果一致，说明添加纤维素酶，尤其在添加纤维素酶基础上添加淀粉可以达到更好的青贮效果，这可能与淀粉水解成为微生物发酵底物有关。丁酸是腐败菌和酪酸菌分解蛋白质、葡萄糖和乳酸的产物，一般认为优质青贮饲料的丁酸含量应低于1%[29-30]。黄媛等[31]在构树青贮中添加糖蜜和纤维素酶，未检测出丁酸。在本试验中，没有检测出丁酸，说明象草青贮过程中有害微生物被抑制。

贾燕霞等[1]在象草青贮中添加酶制剂后提高了象草青贮的发酵品质。王永新等[32]研究表明，将鲜汁2%的甘蔗糖浆添加到狼尾草中进行青贮，青贮饲料的发酵品质得到明显提高。本试验中，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的弗氏评分显著高于对照组；对照组的弗氏等级为尚可，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的等级为良好，说明试验Ⅰ组、试验Ⅱ组象草青贮的发酵品质均得到了提高。

3.3 添加纤维素酶和淀粉对象草青贮微生物数量的影响

纤维素酶能水解植物细胞壁，将青贮原料中部分结构性碳水化合物降解为单糖或双糖，这为乳酸菌的繁殖提供了充足的可供利用底物[29]。荣辉等[33]报道，在象草青贮中添加糖蜜，促进了象草中结构性碳水化合物的降解。靳思玉等[34]添加糖蜜增加了青贮饲料表面可溶性糖含量，使乳酸菌繁殖加速。本试验中，乳酸菌数量由高到低顺序为试验Ⅱ组>试验Ⅰ组>对照组，与上述试验结果一致。酵母菌在青贮过程中是无利的，它会引起青贮饲料倾向于发生二次发酵；霉菌是导致青贮饲料有氧腐败的主要有害微生物，如果青贮密封不严或者没有压实，没有达到厌氧环境，霉菌就会大量生长，分解纤维素和植物细胞壁组分，分解糖和乳酸，改变营养物质构成[35]。周昕等[23]在食叶草青贮中添加糖蜜，所有样品均未检出霉菌。本试验中，所有样品均未检出酵母菌和霉菌，说明所有组象草青贮发酵良好。

3.4 添加纤维素酶和淀粉对象草青贮微生物多样性的影响

青贮过程是一个复杂的微生物共生的体系，多种微生物共同参与，因此对青贮饲料微生物的群落组成进行研究具有重要意义[36]。OTU是人为给定品系、种和属等某一分类单元设置的同一标志，对来自于同一环境的所有样品序列进行合并，并将相似性大于97%的序列归类为一个OTU[37]。alpha多样性是指特定环境或生态系统内的多样性，主要用来反映物种丰富度和均匀度及测序深度[38]。Chao1指数用于判断群落物种的丰富度，其值越大表示物种种类越多；ACE指数用于估算还有多少未被发现的物种，其值越大，样本的真实物种种类越多[39]。本试验中，试验Ⅱ组特有OTU数、Chao1指数和ACE指数均高于对照组和试验Ⅰ组，说明该组样本菌群丰度和多样性水平都得到提高。Shannon指数主要用于描述OTU出现的紊乱及不确定性，不确定性越高，其越高。Simpson指数越高表示样本物种多样性越丰富。周俊华等[37]在甘蔗尾叶青贮中添加微生物添加剂，试验组的Shannon指数、Simpson指数均高于对照组。本试验中，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的Shannon指数、Simpson指数均高于对照组，这说明试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的样本物种多样性比较丰富。

厚壁菌门在大多数青贮饲料中占主导地位，多数为革兰氏阳性，可以产生芽孢抵抗脱水和极端环境，很多芽孢杆菌可以降解纤维素、淀粉、蛋白质等多种大分子化合物[40]。乳杆菌属是厚壁菌门主要的菌属之一，直接影响青贮品质[41]。Eikmeyer等[42]研究报道，在饲草青贮过程中，青贮第14天和第58天厚壁菌门的相对丰度分别为86.00%和87.00%。刘蓓一等[43]研究报道，在大麦青贮期，厚壁菌门是绝对优势菌门。黄媛等[31]在构树青贮中添加糖蜜和纤维素酶后提高了厚壁菌门的相对丰度。本试验结果显示，厚壁菌门是3组象草青贮中的绝对优势菌门，且由高到低的顺序为试验Ⅱ组>试验Ⅰ组>对照组，这与以上试验结果一致。乳酸菌是制作优良青贮饲料的主要微生物，具有抑制腐败菌及其他有害菌繁殖的作用，进而对青贮饲料起到防腐保鲜的作用[36]，魏斯氏菌属也属于乳酸菌。Dellaglio等[44]研究认为魏斯氏菌属在发酵初期起重要作用。豆艳丽等[45]研究报道，全株玉米青贮过程中乳酸杆菌属和魏斯氏属是优势菌属。本试验中，各组均未检测到青贮饲料的重要腐败菌(革兰氏阳性芽孢杆菌属和梭菌属)，各组占绝对优势地位的菌属均为乳杆菌属，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的魏斯氏菌属相对丰度高于对照组。基于门和属水平的分析结果说明，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组象草青贮的发酵品质得到了提升，尤其在添加纤维酶和淀粉的试验Ⅱ组，其微生物多样性表现地更丰富，可能主要和增加了象草的微生物发酵底物有关。

4 结 论

本试验条件下，单独添加纤维素酶和混合添加纤维素酶与淀粉均能够提高象草青贮的营养成分含量、发酵品质、乳酸菌数量、微生物多样性、厚壁菌门和魏斯氏菌属的相对丰度，且混合添加纤维素与淀粉时提高作用更明显。综上所述，混合添加纤维素酶与淀粉对象草青贮发酵品质和微生物多样性的提高效果较佳。