白扁豆配方颗粒质量标准研究

李素梅，毕晓黎，胥爱丽，李养学，江洁怡，张靖年，李若菲

[1.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）/广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州 510095；2.中山大学新华学院，广东广州 510520]

白扁豆来源于豆科植物Dolichos lablabL.的干燥成熟种子，在我国分布广泛，为常用药食两用中药，具有健脾化湿、和中消暑的功能，主要用于治疗脾胃虚弱、食欲不振、暑湿吐泻、大便溏泄、白带过多等[1]。白扁豆主要含有蛋白质、多糖、脂肪、铁、钙、磷、维生素等营养成分[2]，此外还含有甾体、苷类、葫芦巴碱等成分[3]。研究表明，白扁豆具有抗病毒、抗菌[4]、抗氧化[5-6]、保护缺氧性神经细胞的凋亡坏死[7]、防治酒精性肝病[8]等药理活性。《中国药典》收载有白扁豆，其质量控制仅有性状、横切面显微鉴别、水分检查，未收载定性定量质控指标。目前，白扁豆质量控制研究方面的文献相对较少，仅有白扁豆总磷脂含量测定[9]和白扁豆中哌林可酸定性定量研究的报道[10]。

白扁豆配方颗粒是由合格的白扁豆饮片经提取、浓缩等现代制剂工艺制备而成的可供临床直接配方使用的颗粒剂[11]。目前，不同生产企业白扁豆配方颗粒质量标准参差不齐，无统一的标准，多为性状、浸出物等质控指标，缺少定性和含量测定指标，导致临床疗效不能保证。因此，建立白扁豆配方颗粒定性、定量质量控制方法显得十分必要。葫芦巴碱是白扁豆中所含的两性季铵盐类生物碱，具有降血糖、抗肿瘤、降血脂[12-16]、抗感染、抗菌、镇痛等活性[17]。葫芦巴碱药理活性与白扁豆药理活性具有一定的相似性，本研究选择其为白扁豆配方颗粒质量控制指标，采用白扁豆对照药材和葫芦巴碱随行对照，建立白扁豆配方颗粒薄层色谱定性鉴别方法，采用高效液相色谱法测定白扁豆配方颗粒中葫芦巴碱的质量分数，旨在为白扁豆质量标准的制订提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

KQ-700DE超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）；澳华HH-2恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；DH-9203恒温电热烘箱（上海精密实验设备有限公司）；ATS4卡玛自动点样机（瑞士卡玛公司）；卡玛成像系统（瑞士卡玛公司）；TLE-204万分之一、Mettler XS 205 DU十万分之一梅特勒电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；1200安捷伦液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）。

1.2 试药

白扁豆对照药材（批号：AF 00120351）购自成都埃法生物科技有限公司；葫芦巴碱（批号：H-057-180110，质量分数：98%）购于成都瑞芬思生物科技有限公司；白扁豆配方颗粒10批：批号8060101（编号S1）、批号0062471（编号S2）、批号0093521（编号S3）、批号9041951（编号S4）、批号0072761（编号S5）、批号0091501（编号S6）、批号9072151（编号S7）、批号9120761（编号S8）、批号0122231（编号S9）、批号9024401（编号S10），均由广东一方制药有限公司提供；乙腈为Merck色谱纯试剂，液相用水为屈臣氏水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 白扁豆配方颗粒定性鉴别

2.1.1 定性鉴别方法Ⅰ取白扁豆配方颗粒0.5 g，研细，加入70%（体积分数，下同）乙醇30 mL，超声处理提取30 min，提取液蒸干，残渣加70%乙醇1 mL溶解，制得供试品溶液。另取白扁豆对照药材1.00 g，置250 mL烧杯中，加100 mL水，加热煎煮使之保持微沸30 min，放冷后滤过，滤液置水浴锅上蒸至剩约5 mL，用适量硅藻土吸附，蒸干并转移至锥形瓶中，自“加入70%乙醇30 mL”起，同法制得白扁豆对照药材溶液。按照《中国药典》四部通则0502项下薄层色谱法操作，吸取上述供试品溶液2 μL、白扁豆对照药材溶液4 μL，分别点样在同一硅胶G薄层板，以正丁醇-冰醋酸-水（体积比19∶5∶5）作为展开剂[1]，展开，取出晾干后，以茚三酮试液为显色剂，在105℃烘箱中加热使斑点显色清晰，结果见图1。可见，供试品色谱中，在与白扁豆对照药材色谱相同Rf值位置处，显相同颜色的斑点，10批配方颗粒TLC鉴别均可检出对应斑点。

图1 10批白扁豆配方颗粒薄层鉴别图Figure 1 TLC of ten batches of Lablab Semen Album granules

2.1.2 定性鉴别方法Ⅱ 取白扁豆配方颗粒0.20 g，研细，加30 mL甲醇，超声处理提取30 min，提取液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，制得供试品溶液。另取白扁豆对照药材2.00 g，加30 mL甲醇，同法制得白扁豆对照药材溶液。再取葫芦巴碱对照品适量，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL的对照品溶液。

按照《中国药典》四部通则0502项下薄层色谱法操作，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于在同一硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-甲醇-水（体积比4∶2∶4）作为展开剂展开，取出晾干后，在波长为254 mm的紫外光灯下检视，结果见图2。可见，供试品色谱中，在与白扁豆对照药材和葫芦巴碱对照品色谱相同Rf值位置处，显相同颜色的斑点，10批配方颗粒TLC鉴别均可检出对应斑点。

图2 10批白扁豆配方颗粒葫芦巴碱薄层鉴别图Figure 2 TLC of ten batches of Trigonelline of Lablab Semen Album granules

2.2 葫芦巴碱质量分数的测定

2.2.1 色谱条件 以GRACE Econosphere Amino柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，柱温为25℃，以乙腈-水（体积比80∶20）为流动相[18-19]，流速为1 mL/min，检测波长为265 nm。

2.2.2 葫芦巴碱对照品储备液的配制 精密称取葫芦巴碱对照品5.24 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容至刻度线，制成质量浓度为0.205 4 mg/mL的对照品储备液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取白扁豆配方颗粒适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加25 mL 70%甲醇溶液为提取溶剂，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）提取30 min，取出放冷后，补足质量，摇匀并滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 专属性试验 分别取空白溶剂、葫芦巴碱对照品溶液、供试品溶液，进样10 μL，按照“2.2.1”项色谱条件测定，采集色谱图，结果见图3。可见，空白溶剂对葫芦巴碱的测定无干扰，具有较好的专属性。

图3 白扁豆配方颗粒葫芦巴碱测定的HPLC图Figure 3 HPLC of content of trigonelline in Lablab Semen Album granules.

2.2.4.2 葫芦巴碱线性考察 取“2.2.2”项的葫芦巴碱对照品储备液，分别精密吸取1、1.5、2.5、5、7.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即制得质量浓度分别为20.54、30.81、51.35、102.7、154.05 μg/mL的对照品溶液，分别精密吸取已配制的对照品溶液及对照品储备液（0.205 4 mg/mL）各10 μL，进样，按照“2.2.1”项色谱条件测定并记录峰面积，以葫芦巴碱峰面积为纵坐标（Y）、葫芦巴碱进样的量（μg）为横坐标（X）进行回归，得回归方程Y=1 426.212 79X+2.651 1497（r=1.000 0），结果表明葫芦巴碱进样量在0.205 4～2.054 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.2.4.3 精密度试验 精密吸取白扁豆配方颗粒（S1）供试品溶液10 μL，连续进样6次，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积并计算RSD，结果葫芦巴碱色谱峰峰面积RSD值为0.47%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.4 稳定性试验 精密吸取白扁豆配方颗粒（S1）供试品溶液10 μL，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样测定峰面积并计算RSD，结果葫芦巴碱色谱峰峰面积RSD值为0.48%，表明供试品溶液在12 h内稳定性较好。

2.2.4.5 重复性试验 取白扁豆配方颗粒（S1），研细，取约0.2 g，精密称定质量，按“2.2.3”项方法平行处理6份，按“2.2.1”项色谱条件测定峰面积并计算质量分数，结果葫芦巴碱平均质量分数为10.00 mg/g，RSD值为0.36%，表明方法重复性较好。

2.2.4.6 中间精密度试验 由实验室其他工作人员，在不同时间和仪器上操作，取白扁豆配方颗粒（S1），按“2.2.3”项方法平行处理6份供试品溶液，再按“2.2.1”项色谱条件测定，结果葫芦巴碱色谱峰峰面积RSD值为1.42%，表明方法中间精密度良好。

2.2.4.7 加样回收率试验 精密称取葫芦巴碱对照品12.78 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容至刻度线，制得质量浓度为0.250 5 mg/mL的对照品溶液；再取9个规格为100 mL的具塞锥形瓶，编号1～9号，其中1～3号锥形瓶各分别精密加入2 mL对照品溶液，4～6号锥形瓶各分别精密加入4 mL对照品溶液，7～9号锥形瓶各分别精密加入6 mL对照品溶液，置氮吹仪上吹干溶剂后，再取S1（8060101）白扁豆配方颗粒，研细，取约0.1 g，9份，精密称定，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项色谱条件测定，计算回收率，结果测得平均回收率为103.38%（n=9），RSD为0.98%，表明方法回收率良好，结果见表1。

表1 葫芦巴碱加样回收率试验结果Table 1 Recovery results of trigonelline(n=9)

2.2.5 白扁豆配方颗粒样品质量分数的测定 取S1～S10白扁豆配方颗粒，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项色谱条件测定，10批白扁豆配方颗粒葫芦巴碱质量分数测定结果见表2。可见，10批次白扁豆配方颗粒葫芦巴碱平均质量分数为9.38 mg/g，后续将继续收集多批次样品进行测定，再根据测定结果拟定白扁豆配方颗粒中葫芦巴碱含量限度。

表2 10批次白扁豆配方颗粒葫芦巴碱质量分数测定结果Table 2 Results of content of trigonelline in ten batches of Lablab Semen Album granules(n=2)

3 讨论

白扁豆配方颗粒对照药材定性鉴别主要针对氨基酸类成分进行鉴别，参考了2020年版《中国药典》一部大豆黄卷鉴别项下亮氨酸鉴别的展开剂及显色条件，以正丁醇-冰醋酸-水（体积比19∶5∶5）为展开剂，展开晾干后，以茚三酮试液为显色剂，在105℃加热，结果显示供试品色谱与白扁豆对照药材色谱斑点对应良好。葫芦巴碱薄层色谱鉴别过程中，因葫芦巴碱为两性季铵盐类生物碱，极性较大，展开剂选择方面往极性大的展开系统考虑，曾尝试了无水乙醇-丙酮-盐酸（体积比5∶3∶0.5）展开剂，但是展开效果不好，经摸索调整为正丁醇-甲醇-水系统，比例为正丁醇-甲醇-水（体积比4∶1∶4）时，葫芦巴碱斑点Rf值较低，经调整为正丁醇-甲醇-水（体积比4∶2∶4），斑点Rf值适中，斑点对应良好；另外，葫芦巴碱在265 nm下有最大紫外吸收，故采用GF254板为固定相、254 nm为检视波长，可较好地鉴别葫芦巴碱斑点。另外，对所建立的薄层色谱鉴别方法进行了耐用性考察，分别考察了自制硅胶G薄层板/自制硅胶GF254薄层板和默克硅胶G预制板（批号：MX98383926）/默克硅胶GF254预制板（批号：MC41365054）、不同温度（25℃、4℃）、不同湿度（25%、75%）条件下的展开情况，结果显示所建方法耐用性均较好。

白扁豆配方颗粒葫芦巴碱质量分数测定方法研究建立过程中，因葫芦巴碱极性较强，在一般C18反相柱上吸附较弱，导致出峰较早，故选择氨基键合柱进行分析。供试品溶液的制备分别考察了不同提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、20%甲醇）、不同提取方式（超声、加热回流）、提取溶剂料液比（1∶1、1∶2）、提取时间（15、30、45 min）的葫芦巴碱提取效果，结果以70%甲醇25 mL为提取溶剂、超声处理30 min的提取效果较好。另外，分别考察了不同厂牌色谱柱（Phenomenex Luna NH2柱、GRACE Econosphere Amino柱、Waters Xbridge Amide柱）、以及不用柱温（20、25、30℃）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）等色谱耐用性影响因素，综合考虑色谱峰峰形、分离度、压力、分析时间等因素，确定最终色谱条件。

本研究建立的白扁豆配方颗粒的定性与定量方法简便可行、重复性好、准确可靠，可为白扁豆配方颗粒质量标准的制订或标准提高及质量控制提供参考。