PACAP27对Ⅱ型糖尿病诱导的睾丸损伤的保护作用

卢晓芳，梁英杰，廖定准，王冰洋，柴翠翠*

（1中山大学附属第七医院病理科，深圳518107；2中山大学附属第一医院病理科，广州510080）

随着人们生活水平的改善和经济的快速发展，糖尿病已成为全球范围的流行病，且发病率呈上升趋势。据世界卫生组织（WHO）预测，2025年受糖尿病影响的人数会增加到3亿[1]。作为一种慢性代谢病，糖尿病以糖脂代谢紊乱为主要特征，长期的高血糖也引起一些并发症，无论是I型还是II型糖尿病，均会造成一定程度的血管损害[2]。有研究表明，糖尿病患者氧化应激及血管损伤被认为是导致生殖系统损害的主要原因[3]。

糖尿病的传统治疗主要以控制血糖和延缓症状为主，由于其局限性和不良反应，越来越多的研究关注于内源性多肽及其一些下游信号通路的关键因子[4]。1989年Arimura团队从绵羊的下丘脑中分离得到的一种新型促垂体神经肽—垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP），其属于促胰液素/胰高血糖素/血管活性肠肽家族[5]。研究发现，PACAP在培养的大鼠垂体前叶细胞中能刺激腺苷酸环化酶的活性，显著增加cAMP的形成，因此将它命名为垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）。PACAP在人体的各个组织中表达，主要以PACAP38和PACAP27两种形式存在，其中PACAP27的氨基酸序列与血管活性肠肽的同源性达到68%，因此认定PACAP27属促胰液素/胰高血糖素/血管活性肠肽家族[6]，功能主要表现在可以促进胰岛素的释放、促进神经递质释放、血管舒张、细胞增殖分化等。研究发现内源性PACAP27的水平与Ⅱ型糖尿病有一定的相关性，每日腹膜内注射PACAP27，可有效降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠循环血糖的含量[7]。

PACAP27分布广泛，发挥多种生物学功能，其中一个非常重要作用是通过抑制细胞凋亡、炎症反应以及氧化反应，起到细胞保护作用；同时，由于PACAP27属于促胰液素/胰高血糖素，其在糖尿病以及相关并发症中的作用值得进一步探索[8]。本研究使用构建的糖尿病模型鼠，通过PACAP27干预，检测其对糖尿病诱导的睾丸氧化应激和睾丸血管损伤的保护作用，以及睾丸生精细胞凋亡的抑制作用，从而为糖尿病引起的生殖障碍的治疗提供新思路。

材料与方法

1 材料

雄性SD大鼠由中山大学实验动物中心提供，饲料购自南通特洛菲饲料技术有限公司，所有实验操作均符合中山大学动物实验中心动物伦理要求并按照实验动物使用原则进行。6只对照组大鼠喂养普通对照饲料，另12只大鼠喂养高脂饲料和腹腔注射链脲霉素（上海生工公司），1周后开始检测尾静脉血糖水平（罗氏，瑞士）。大鼠的随机血糖水平高于16.7 mmol/L即认为是Ⅱ型糖尿病（T2DM），待糖尿病大鼠模型构建成功后（10周时），其中6只每天腹腔注射100ml 1mmol/L PACAP27进行干预（糖尿病PACAP27干预组），另6只和对照组通过腹腔注射等体积的PBS缓冲液，持续5周后，麻醉处死所有大鼠，取出睾丸和附睾。

2 HE染色

将石蜡包埋的睾丸组织制作3mm厚切片（机器型号：LEICA RM2235)，全自动烤封染一体机染色（DAKO CoverStainer），苏木素、伊红试剂（DAKO)，光学显微镜下观察拍照。

3 睾丸组织活性氧和丙二醛浓度检测

将大鼠取出的睾丸组织分成两份分别用冻存管和装有福尔马林溶液的容器存储，冻存管放入液氮罐内长期保存，福尔马林固定的标本24h后经组织前处理，石蜡包埋。从液氮罐中取出等质量的每只大鼠睾丸组织并添加等体积的裂解液进行研磨，匀浆物在提前预冷的离心机中10000r/min转速下离心10min，收集上清液，用于检测。

活性氧（ROS）检测：分别取5μl各组大鼠睾丸组织的上清液，用 495μl样品缓冲液稀释，后转移至24孔板内，在室温孵育10min后，每孔加入5μl 2′，7′-二氯荧光黄双乙酸（DCFH-DA）及40μl亚铁离子，待转化为荧光后，利用发射光荧光分光光度计（美国Bio-Rad公司）通过485nm激发光和530nm检测，记录OD值。

丙二醛（MDA）检测：MDA水平是评估脂质过氧化的指标，通过检测MDA浓度，可判断糖尿病大鼠睾丸的氧化损伤情况。将各组小鼠的睾丸的上清液各取5μl放在已经包被好的ELISA板上，按照说明书步骤进行操作，检测后记录OD值。

4 Western blot法检测睾丸Caspase 9水平

将液氮罐中储存的大鼠睾丸组织标本取等质量后，将组织放入液氮中冷冻后捻碎，后各加100μl裂解液（碧云天，P0013C），混匀后匀浆物在提前预冷的离心机中10000 r/min转速下离心10min，然后，收集上清液，BCA检测试剂盒（碧云天，P0010S）测试提取的睾丸总蛋白的浓度，待每个样本的浓度调配一致后加入蛋白制样缓冲液，煮沸5min，冷却后进行SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳，每孔上样20mg总蛋白，浓缩胶用80V的恒压电泳至浓缩胶电泳结束，电压调到100V继续电泳，待溴酚蓝电泳到底部后关闭，取出凝胶进行转膜，转膜后截取Caspase 9和内参GAPDH区域，封闭后，一抗Caspase 9（碧云天，AC062，鼠抗，1：1000稀释）和GAPDH（碧云天，AF5009，鼠抗，1：1000稀释）4℃孵育过夜，第2d取出洗膜后孵育辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗（碧云天，A0216，1：5000稀释）1h，用增强化学发光液ECL（碧云天，P0018S）在凝胶成像系统上显色，Gel-Pro Analyzer 对 Western blot 结果进行灰度扫描，之后将这些数值录入 Graph Pad 进行统计学分析。

5 免疫组织化学染色

Envision法免疫组织化学染色步骤：石蜡包埋好的睾丸组织制作3μm厚度的石蜡切片，烤箱65℃烤片2h，脱蜡水化后，pH 9.0的EDTA修复液高压修复5min，室温冷却20min，蒸馏水洗1min，PBS洗涤3次，每次2min，后用3%H2O2处理10min以消除内源性过氧化物酶，PBS洗涤3次，将配备好的VEGF 抗体（Abcam，1∶200 稀释）加在染色区域，4℃冰箱湿盒过夜孵育，次日先将湿盒室温复温0.5h，PBS 洗涤3次后，滴加即用型二抗（DAKO公司， K5007），37℃孵育30min，PBS洗涤3次，DAB显色5~10min，水洗，苏木素复染2min，流水返蓝10min，最后将切片依次浸入75%、85%、95%、100%的乙醇中脱水，经二甲苯透明后中性树胶封片，光学显微镜下观察拍照（奥林巴斯，日本）。使用ImageJ软件对免疫组织化学反应产物进行定量分析，以平均光密度代表阳性反应强弱，使用Graph Pad Prism 6.0软件进行差异分析和制图。

6 统计学分析

所有实验数据采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，用Graph Pad Prism 6.0制图，实验数据以均数±标准差表示。MDA及ROS比较采用单因素方差分析（One way-ANOVA），统计学分析均为双侧检验，P<0.05时为差异有统计学意义。

结 果

1 PACAP27缓解糖尿病大鼠体重增加和血糖升高

首先，我们使用高脂饲料饲喂，并腹腔注射链脲霉素构建糖尿病大鼠模型，从1周起开始检测尾静脉血糖水平，10周时随机血糖水平高于16.7mmol/L的大鼠即认定为Ⅱ型糖尿病（T2DM）模型。将糖尿病大鼠随机平均分为2组，其中一组腹腔注射PACAP27，另外一组和对照组通过腹腔注射等体积的PBS缓冲液，继续饲养至15周，定期记录体重和尾静脉血糖水平。

体重记录结果表明：0—10周时，两组糖尿病造模大鼠（糖尿病组、PACAP27+糖尿病组）体重显著高于对照组；而在PACAP27干预后（11-15周），对照组大鼠体重进一步增加，而两组糖尿病造模大鼠体重减少，其中与单纯糖尿病组相比，PACAP27干预后的糖尿病大鼠（PACAP27+糖尿病组）体重减少较少（图1A）。

尾静脉血糖值变化发现：与对照组相比，糖尿病组血糖显著升高；而使用PACAP27干预后，糖尿病大鼠的血糖水平显著下降，但仍高于非糖尿病对照组（图1B）。

图1 PACAP27对糖尿病大鼠体重及血糖的影响。A，体重变化曲线；B，血糖浓度变化曲线；与对照组比较：**0.001

2 PACAP27干预减轻糖尿病大鼠睾丸组织形态改变

HE染色检测3组大鼠睾丸组织形态发现：糖尿病组大鼠的睾丸组织形态明显受损，部分曲系精管塌陷，形状不规则，生精细胞和精子减少（图2B）；当用PACAP27干预5周后，睾丸组织形态受损明显减轻，曲系精管形态结构趋向于恢复，生精细胞和精子数量恢复（图2C）。

图2 HE染色检测3组大鼠的睾丸组织形态。A，对照组；B，糖尿病组；C，糖尿病PACAP27干预组；比例尺，200μmFig. 2 HE staining for examination of the morphological change in rat testicular tissues. A, control group; B, diabetes group; C, PACAP27 intervention diabetes group; scale, 200μm

3 PACAP27干预减轻糖尿病大鼠睾丸及附睾氧化应激

活性氧（ROS）和MDA水平是判断氧化应激的重要指标。检测3组大鼠睾丸及附睾组织中的ROS和MDA的浓度发现：与对照组相比，糖尿病组中的ROS和MDA的浓度均显著增加，分别为照组的221%与196%；而PACAP27干预后，ROS和MDA浓度均较糖尿病组显著降低（图3）。

图3 PACAP27干预对糖尿病大鼠睾丸和附睾中活性氧和丙二醛水平的影响。A，ROS；B，MDA；***P<0.001, **0.001

4 PACAP27缓解了糖尿病诱导的大鼠睾丸生精细胞凋亡水平

Western blot检测显示，糖尿病组Caspase 9蛋白水平显著增加，PACAP27干预能够显著降低糖尿病大鼠Caspase 9蛋白水平（图4）。

图4 PACAP27干预对糖尿病大鼠睾丸组织中Caspase 9水平的影响。A，大鼠睾丸组织中Caspase 9水平代表性Western blot检测结果；B，Caspase 9水平统计学分析；*P<0.001Fig.4 Effect of PACAP27 intervention on the level of Caspase 9 in the testicular tissues of diabetic rats. A, representative results of Caspase 9 level detected by Western blot; B, statistical analysis for Caspase 9 level;*P<0.01

5 PACAP27干预抑制糖尿病大鼠睾丸组织内血管内皮生长因子的降低

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）可促进血管的生成和通透性，主要在血管组织中表达。检测睾丸中VEGF的表达，可反应睾丸中血管的健康状况[9]。免疫组织化学染色发现：正常睾丸组织，VEGF免疫反应阳性产物定位于生精细胞（精原细胞强阳性，其它各级生精细胞弱阳性）及成熟精子，而睾丸间质细胞及曲细精管之间的结缔组织均阴性或散在个别细胞弱阳性；与对照组相比，糖尿病组大鼠睾丸组织中各级生精细胞及成熟精子数量均减少，其VEGF免疫反应性亦显著低于对照组；与糖尿病组相比，PACAP27干预组大鼠睾丸组织中各级生精细胞数量均有所恢复，其VEGF免疫反应性亦较糖尿病组大鼠明显恢复（图5）。

图5 PACAP27干预对糖尿病大鼠睾丸组织中VEGF免疫反应性的影响。A1，对照组。A2，糖尿病组。A3，PACAP27干预组。比例尺：A1和A2，20µm；A3，50µm。B，VEGF免疫反应性阳性强度统计学分析；***P<0.001Fig.5 Effect of PACAP27 intervention on the vascular endothelial growth factor immunoreactivity in the testicular tissues of diabetic rats. A1, control group. A2, diabetes group. A3, PACAP27 intervention diabetes group. Scale bar: A1 and A2, 20µm; A3, 50µm. B, statistical analysis for VEGF immunoreactivity; ***P<0.001

讨 论

糖尿病是以长期高血糖症为主要特征并伴随着慢性炎症的代谢性疾病，目前全球已有4亿多的糖尿病患者，其中大部分是Ⅱ型糖尿病患者。当前针对Ⅱ型糖尿病的治疗主要以通过改善胰岛素抵抗和提高胰岛素功能，但相关类药物的长期使用具有局限性和一些副作用。因此，探寻新颖和治疗效果好的生物药物成为当前的热点[9,10]。

糖尿病是一种慢性代谢疾病，长期的代谢失调会导致身体其它器官的损伤，例如男性睾丸的损伤，其主要原因是糖尿病患者氧化应激及血管微循环障碍。随着糖尿病的多发趋势，缓解、治疗糖尿病引起的睾丸血管损伤，是保护男性生殖健康的重要研究领域[11,12]。

PACAP27是血管活性肠肽/分泌素/胰高血糖素的家族成员，研究已证实PACAP27不仅可以保护各种细胞免受神经毒素的损害或应激反应诱导的细胞凋亡，还能通过不同途径减轻糖尿病引起的各种并发症[13]。另有研究证实升高内源性PACAP不但可以提升精子的活力和穿透力，而且对缺乏内源性PACAP的小鼠导致的精子功能异常可起到改善作用[14]。近期有研究发现PACAP可通过调节男性性激素（T、E2、FSH和LH）水平来减少睾丸生精细胞凋亡，从而提高肥胖小鼠精子和早期胚胎质量，而PACAP27是PACAP的主要亚型[9]。

在本研究中，PACAP27干预后的糖尿病大鼠（PACAP27+糖尿病组）体重减少，血糖水平显著下降，这与之前的研究结果一致，说明PACAP27多肽是治疗糖尿病的一个潜在靶点，但其具体机制尚不清楚[14]。我们通过组织形态观察以及相关实验检测发现，高脂诱导的糖尿病大鼠睾丸组织形态明显受损，ROS和丙二醛浓度显著增加，凋亡蛋白水平显著上调；而使用PACAP27干预5周后，能够显著改善糖尿病引起的大鼠睾丸氧化应激和睾丸血管损伤。以上结果充分说明PACAP27对雄性糖尿病大鼠的睾丸生殖能力有明显的改善作用。先前的研究证明，PACAP可增强精子的活力和穿透能力，促进小鼠和人类的受精，而内源性PACAP的缺乏导致精子功能异常，外源性的PACAP通过激活PKA/CREB/Sirt1/p53信号通路来保护肥胖诱导的男性生殖损伤，从而减少生精细胞的凋亡[14]。本研究进一步探索PACAP的主要亚型PACAP27主要通过减轻糖尿病大鼠睾丸氧化应激水平、保护睾丸血管生成，从而改善糖尿病大鼠的生殖能力，将有望开发成为改善糖尿病引起的男性生殖障碍的新型药物。