miR-30a与其靶基因在肝癌中的作用研究进展

梁雨，沈涛

（昆明理工大学附属医院·云南省第一人民医院，云南省临床病毒学重点实验室，云南省第一人民医院感染性疾病及肝病科，云南省第一人民医院肠道微生态相关疾病机制和转化应用研究省创新团队，昆明650032）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年造成大约70万人死亡，被认为是第三大癌症死亡原因[1]。已有报道显示，由于缺乏敏感和特异性的生物标志物，肝癌不易早期发现，从而极大地阻碍了其治疗的有效性。目前，肝细胞癌最常用的血清生物标志物是甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP），但其在肝癌早期诊断中的价值有限[2]。因此，迫切需要寻找新的生物标记物来提高肝癌的早期发现和治疗。

microRNAs（miRNAs）是一个内源性RNA家族，是长度约为18~25nt的非编码调控RNA，在基因表达的转录后调控中发挥重要作用。miRNA通过互补碱基配对与特定的mRNA相互作用，从而影响靶基因的表达或稳定性。许多研究表明，miRNAs的表达改变与多种生理过程和病理过程（包括癌症、心血管疾病和代谢性疾病）密切相关[3]。因此，它们是潜在的稳定的非侵入性生物标志物。在肝癌发生发展过程中，miRNAs表达随疾病进程不同呈显著差异，随着对miRNAs研究的深入，一些关键miRNAs在肝癌发展过程中的抑癌特性被发现，因此，以miRNAs开发癌症诊疗方法可能是一种安全和有前景的途径[4]。

miR-30a是近几年来研究比较热门的miRNAs之一，在胃癌，结肠癌，前列腺癌和肝癌等恶性肿瘤中表达下调，并且可调控癌细胞的增殖，迁移，凋亡等行为，对肿瘤的发展产生一定影响。本文将近几年在肝癌中发现的miR-30a靶基因及其可能的调控机制做一综述，以便部分阐明miR-30a的功能及其在肝癌进展中的作用。

1 miR-30a与HCC

miR-30a定位于6号染色体，其家族成员包含miR-30b、miR-30c1、miR-30c2、miR-30d和 miR-30e，分别定位于不同染色体。miR-30家族成员与多种人类恶性肿瘤相关，在癌组织中表达水平一般下调，并可通过靶向不同的靶基因实现对癌细胞恶性生物学行为的调控，进而影响肿瘤的发生发展。

研究报道显示，miR-30a是与转移性肝细胞癌(HCC)相关microRNAs之一。miR-30a在肝癌组织和细胞系中表达下调，与肝癌的血管侵袭、转移潜能和复发密切相关。有研究发现，miR-30的过表达对于肝癌细胞的细胞活力，增殖，迁移具有显著抑制作用[5]，提示其在肝癌的发生发展过程中可能扮演抑癌基因的角色[6]，在肿瘤的诊断中具有重要的参考价值。

2 miR-30a通过靶基因对HCC的调控

已有研究证实，在肝癌组织和相应癌细胞系中miR-30a通过调控其靶基因的表达水平能够抑制肝癌细胞系的增殖、迁移和侵袭，并且诱导细胞凋亡。随着包括异黏蛋白（metadherin，MTDH）、K-Ras、叉头框蛋白A1 （recombinant forkhead box protein A1,FOXAl）、Snai1蛋白、波形蛋白（Vimentin）、肺腺癌转移相关转录因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）及自噬基因Beclin1等越来越多的miR-30a作用靶标被发现，其在肝癌进展中的作用也被逐渐认识。

2.1 miR-30a通过靶基因调控HCC增殖与凋亡

MTDH又被命名为星形细胞上调基因-1（astroeyteelevatedgene-1，AEG-1）。MTDH作为一种原癌基因，其在HCC患者肿瘤组织中较癌旁组织表达增高，且在HCC细胞系较正常肝细胞系表达增高[7,8]。研究发现，MTDH过表达可激活Wnt/β-catenin、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、NF-κB和PI3K/Akt信号通路，并加速其下游基因的表达，从而促进肿瘤的增殖、克隆形成及抗凋亡。此外，MTDH可抑制磷酸酶和张力蛋白同系物（phosphatase and tensin homolog，PTEN，也称 mutated in multiple advanced cancers 1，MMAC1）转录而降低PTEN的表达[7]。PTEN是PI3K/AKT通路的主要负调控因子，其编码的蛋白对磷脂酰底物有脱磷脂效应，可抑制蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的磷酸化，从而阻止肿瘤细胞的增殖、迁移、肿瘤血管生成等病理过程。研究表明MTDH在细胞质、细胞膜及细胞核中都有表达，且其 mRNA序列3’-UTR含有两个与miR-30a-5p的结合位点，分别位于287-294nt和1569-1577nt[7]，可作为miR-30a的直接靶标而转录受到抑制。临床样本数据显示，miR-30a-5p在肝癌组织中的表达水平显著降低[9]。利用miR-30a-5p模拟物转染肝癌细胞HepG2及SMCC-7721后，细胞中MTDH水平明显降低，而PTEN表达随之升高，细胞增殖及克隆形成受到抑制、凋亡增加，即miRNA-30a-5p通过miRNA-30a-5p-MTDH-PTEN/AKT轴降低了肝癌细胞的增殖、侵袭及促凋亡，从而抑制了肝癌的发展[7,8]。

K-Ras是RAS基因家族成员之一，作为一种原癌基因，其编码的K-Ras蛋白具有GTPase活性，在多个信号通路中充当分子开关的作用。k-ras基因在多种肿瘤中都具有突变，在胰腺癌、结直肠癌和肺癌等最为常见，ras突变后的产物可以一直处于活化状态，与肿瘤的生成、增殖、迁移、扩散以及血管生成均有关系。通过双荧光素酶报告基因检测表明miR-30a可直接与K-Ras mRNA的3’-UTR结合，并使其下调。进一步机制研究发现，在HepG2和MHCC97L癌细胞中，miR-30a的过表达完全阻断了K-Ras/c-Raf/MEK/ERK通路的激活，抑制肝癌细胞的生长，迁移并诱导细胞凋亡[10]。提示miR-30a通过靶向K-Ras可能调节k-Ras/c-Raf / MEK / ERK信号通路部分功能，在肝癌细胞的生长，凋亡和转移中发挥抑制作用。

FOXAl是FOXA家族的重要成员之一，主要参与肝脏发育和代谢。FOXAl是一种转录因子，已发现它可以通过突变以三种不同的方式转化为癌基因，分别为FAST、FURIOUS和LOUD，从而驱动癌症的发生[11]。双荧光素酶报告系统显示miR-30a能够直接与FOXAl mRNA的3’-UTR结合。进一步研究发现，miR-30a模拟物转染HepG2细胞后，FOXAl的蛋白水平出现显著降低，而上调FOXAl的表达则可逆转miR-30a对HCC细胞增殖的抑制作用，提示miR-30a可通过抑制FOXAl的蛋白表达而抑制肝癌细胞的增殖[12]。同时，有研究发现FOXAl也被miR-212负性调控[13]，提示FOXAl在肝癌的发生发展过程中可被多个不同的miRNAs所调控，可作为HCC重要的分子治疗靶点。

2.2 miR-30a通过靶基因调控HCC转移和侵袭

上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移等过程中具有十分重要的地位。在肿瘤的恶性演进过程中，EMT使得肿瘤细胞得以侵袭和转移，还可能使肿瘤细胞逃逸某些因素诱导的凋亡[14]。因此，在肿瘤的研究中，EMT的发生预示肿瘤恶性进程。EMT最显著的特征就是E-钙粘蛋白（E-cadherin, E-cad）表达的降低，同时波形蛋白（vimentin）表达的升高。这两种蛋白在EMT过程中发挥重要作用，E-cadherin是代表上皮性的标记物，vimentin是代表间叶性的标记物。而Snai1是一个与EMT密切相关的转录因子，它能够抑制E-cadherin表达并促进肿瘤的迁移和侵袭[15]。研究发现，利用miR-30a模拟物或抑制剂转染MHCC-97H和Hep3B细胞后，miR-30a在细胞中过表达促进E-cadherin表达，降低vimentin表达，从而逆转EMT。进一步研究发现，细胞中转入miR-30a可导致内源性Snai1蛋白和mRNA的表达下调，而使用拮抗剂阻断内源性miR-30a可导致Snai1蛋白和mRNA上调，表明Snai1同样也是miR-30a的直接功能靶点，miR-30a通过靶向EMT相关的转录因子Snai1而降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，从而发挥抑癌作用[16]。此外，miR-30a-5p与miR-30a-3p也参与对HCC中EMT过程的调控。其中，相较癌旁组织，miR-30a-3p在HCC癌组织中的表达显著降低。在HCC细胞系中过表达miR-30a-3p可抑制HCC细胞Bel-7402的迁移及侵袭、促进癌细胞凋亡及阻滞在S期。机制研究显示miR-30a-3p通过降低vimentin和MMP3的表达以及恢复E-cadherin的表达来调节肝癌细胞的功能[17]。而miR-30a-5p则可通过靶向vimentin及Snail而调控肝癌的EMT过程，从而抑制HCC的发展。

MALAT1是一种致癌的lncRNA，在多种肿瘤组织和细胞系中高度表达，可影响癌细胞的细胞活力、增殖和迁移、克隆形成、细胞周期分布和肿瘤生长[18]。已发现MALAT1可作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）与miRNAs竞争mRNAs的结合位点，从而使mRNA免受miRNA的调控而得以保持转录后的表达[19]。在HCC的体内、体外模型中发现，敲除MALAT1可延缓细胞增殖、迁移及侵袭。研究发现，MALAT1和miR-30a-5p之间密切相关。沉默MALAT1和过表达miR-30a-5p均可抑制细胞的迁移和侵袭。MALAT1同样作为miR-30a-5p的ceRNA，调节miR-30a-5p的功能，其表达水平与miR-30a-5p呈负相关。并且RT-PCR和Western blot分析表明，MALAT1的低表达抑制了肝癌细胞中vimentin的表达水平[20]。因此，MALAT1-miR-30a-5p-vimentin轴可看作是肝癌潜在的治疗靶点和分子生物学标记物。

2.3 miR-30a通过靶基因调控HCC自噬

beclin 1基因是一种自噬相关基因，它与Bcl-2基因相互拮抗调控细胞自噬。已有研究证实，上调细胞中beclin 1的表达水平可促进自噬的产生，抑制肿瘤的发展[21]。自噬作为细胞自我保护的重要机制，可通过降解细胞内受损、变性或衰老的蛋白质、细胞器等实现细胞稳态和细胞器更新的过程。但有关自噬在肿瘤发生发展过程中的作用，不同的报道呈现出不一致性。有研究显示，体内和体外实验中，单独或联合使用芦荟素和二甲双胍均可增加自噬蛋白beclin 1、LC3II及ATG8的表达，且可通过抑制磷酸化PI3K、AKT及mTOR水平而促进肝癌细胞HepG2和Bel-7402的凋亡及自噬，从而抑制肿瘤的增殖[22]。已发现野生型自噬蛋白beclin 1可促进自噬而抑制肿瘤的增殖、侵袭等。beclin1的第295位色氨酸残基可以被AKT以不依赖于mTOR的方式磷酸化，磷酸化的beclin 1（S295）可进一步与14-3-3蛋白和中间丝蛋白vimentin形成复合物，从而抑制自噬并促进肿瘤发生[23]。但另有研究显示，自噬可能通过促进肝癌细胞的抗失巢凋亡和肺部克隆化而促进肝癌的转移[24]。实验研究表明miR-30a对肝癌细胞具有抗失巢凋亡抑制作用。进一步机制研究发现，自噬相关蛋白beclin 1和ATG （autophagy protein 5，ATG-5）是miR-30a的直接下游靶点，介导miR-30a对肝癌细胞自噬活性的影响。利用miR-30a模拟物处理HCCLM3细胞发现，miR-30a的过表达导致beclin 1和ATG5的蛋白表达下调，并在饥饿条件下降低了HCCLM3的自噬，从而抑制肝癌细胞的转移[25]，提示基于自噬的肝癌组织特异性靶向治疗可能成为肝癌转移治疗的新策略。

3 小结与展望

除了甲胎蛋白外，miRNAs的表达水平也可以作为肝癌更有效的血液早期检测生物标志物[26]。与邻近组织相比，miR-30a在HCC中的表达显著下调，引起一系列靶基因的异常表达，促进肿瘤的发生、发展和迁移，但miR-30a的过表达会抑制肝癌细胞的增殖以及在体内外的迁移和侵袭，并诱导癌细胞凋亡，阻止肝癌的发展，提示在肝癌背景下，miR-30a大多被认为是一种肿瘤抑制因子，然而miR-30a在肿瘤中的研究仍处于初步阶段，更多的靶基因以及作用机制尚未完全清楚。因此，深入探索miR-30a在肝癌中新的作用靶点，以及在肿瘤发展过程中产生的分子机制，将有利于进一步揭示其在肿瘤诊断和治疗中的潜在价值。