D101大孔树脂纯化黑骨藤总皂苷工艺研究

刘 刚，吴 燕，刘育辰*，万传琪，李正鲜，张永萍

(1.贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550003)

黑骨藤PeriplocaforrestiiSchltr.为萝藦科植物西南杠柳的根或全株，性热，味苦，具有通经、活血、解毒和祛风等功效，主要用于治疗风湿关节痛、跌打损伤、月经不调[1]。最早收载于明代本草学家兰茂著的《滇南本草》中[2]。研究发现，黑骨藤中含有皂苷类[3]、苯丙素类[4-5]、黄酮类[6]、强心苷类[7]等多种成分，其中皂苷类成分与其抗炎作用有密切联系[8-9]。大孔吸附树脂技术因其具有价格低、可重复利用、易操作、对有机成分选择性较高、吸附性能好等诸多优点，广泛应用于中药皂苷类[10-11]、黄酮类[12-13]、香豆素类[14]、生物碱类[15]、多酚类[16]等多种化学成分的纯化。本实验探讨了大孔树脂对黑骨藤中总皂苷的影响，并在此基础上优选出最佳纯化条件，为黑骨藤总皂苷的后续研究和开发利用提供支持。

1 实验材料

1.1 仪器

UV-5900紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；电子天平(奥豪斯仪器(常州)有限公司)；精密电子天平(余姚市金诺天平仪器有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；DZKW-4电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药材

本实验所用黑骨藤于2015年3月采自贵州省贵阳市惠水县九龙寺，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为萝藦科杠柳属黑骨藤PeriplocaforrestiiSchltr.。药材样品保存于贵州中医药大学植物化学实验室。

1.3 药品与试剂

冰醋酸、甲醇、高氯酸、乙醇皆为分析级。熊果酸(批号：GZDD-0052)购于贵州迪大生物科技有限责任公司。大孔吸附树脂AB-8-II、D101、XAD7HP、X-5，购自北京慧德易科技有限公司；大孔吸附树脂HP-20，购自北京绿百草科技发展有限公司。

2 方法与结果

2.1 总皂苷含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取熊果酸对照品5 mg，加甲醇溶解并制成0.1 mg/mL对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液制备 取黑骨藤粉末500 g于圆底烧瓶中，加70%乙醇水浴回流提取3次，每次1 h，滤过，合并滤液，浓缩，加蒸馏水定容至1 000 mL，即得。

2.1.3 标准曲线绘制 精密量取对照品溶液0 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于具塞试管中，水浴挥干溶剂，依次加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL 70%高氯酸溶液，在60 ℃水浴中加热15 min，取出后立即冰浴5 min，加入5 mL冰醋酸显色，摇匀，静置10 min，以试剂空白为参比，在550 nm波长下测定吸光度(Abs)，以熊果酸浓度(x)为横坐标，吸光度(y)为纵坐标进行线性回归，得出回归方程为y=41.995x+0.009(R2=0.998 2)，结果表明熊果酸质量浓度在0.003 3～0.011 7 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 精密吸取熊果酸对照品溶液0.7 mL置于具塞试管中，平行6份，参照“2.1.3”项下方法操作，在550 nm处测定吸光度(Abs)，并计算其RSD为1.12%，说明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 精密吸取0.7 mL对照品溶液于具塞试管中，按“2.1.3”项下方法操作，在30 min内从起始时间开始计时，每5 min测定1次吸光度，计算其RSD为1.43%，表明此方法稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取6份黑骨藤药材，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”下操作在550 nm波长处测定其吸光度，计算总皂苷含量得其RSD为0.96%，表明此方法重复性良好。

2.1.7 回收率试验 精密称取6份已知总皂苷含量的供试品溶液，分别加入一定量的熊果酸对照品溶液，按“2.1.3”项下的方法平行操作6份，计算总皂苷含量，结果平均回收率为97.66%，RSD为1.54%，结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.2 黑骨藤总皂苷纯化工艺考察

2.2.1 不同型号大孔树脂的静态吸附及解析研究 称取5种不同型号的大孔吸附树脂各10 g，置于锥形瓶中，加入供试品溶液20 mL，适当振摇，静置24 h后，抽滤，得吸附后滤液1。将吸附后的树脂加入95%乙醇25 mL进行第1次解吸，抽滤，得到滤液，重复解吸5次，合并解吸液，按“2.1.3”项下操作进行总皂苷含量测定，并计算大孔吸附树脂对总皂苷的吸附率和解吸率，结果见表2，由表2可知，5种大孔树脂对黑骨藤总皂苷的吸附和解吸能力有所差异。综合考虑：D101型大孔吸附树脂应用最为广泛，故确定最佳大孔吸附树脂为D101。

吸附率(%)=(C0V0-C1V1)/(C0V0)×100%

解吸率(%)=(C2V2)/(C0V0-C1V1)×100%

式中：C0为吸附液初始浓度(mg/mL)，V0为吸附液体积(mL)，C1为滤液1浓度(mg/mL)，V1为滤液1体积(mL)，C2为洗脱液浓度(mg/mL)，V2为洗脱液体积(mL)。

表2 大孔树脂型号筛选 (%)

2.2.3 上样液浓度考察 4根预理好D101大孔树脂柱(1 BV=15 mL)，湿法上柱，取原药浓度分别为20.80 g/mL、8.23 g/mL、4.16 g/mL、2.082 g/mL上样液10 mL、25 mL、50 mL、100 mL，以适宜流速进行动态吸附，上样后分别用3.33BV水洗脱，合并流出液和水洗液，测定总皂苷含量，计算树脂吸附率。由图1可知，总皂苷吸附率随着上样液浓度增加而逐渐上升，当上样液浓度为20.80 g/mL时，吸附率最高，故上样液浓度为20.80 g/mL。

图1 上样浓度考察(g/mL)

2.2.4 最大上样量考察 药材树脂比例考察。装4根D101大孔树脂柱(1 BV=15 mL)，加入上样液20 mL，以适宜上样流速进行动态吸附，用蒸馏水洗脱至无色，合并流出液和水洗液，测定总皂苷含量，计算吸附量(皂苷mg/g树脂)。如图2，4根大孔树脂的平均吸附量为20.97 mg/g树脂，相当于0.5 g原药材(1 mL上样液)，即药材树脂比例为0.5 g/g树脂。吸附量(mg/g)=(C0V0-C1V1)/m，式中：C0为吸附液初始浓度(mg/mL)，V0为吸附液体积(mL)，C1为滤液1浓度(mg/mL)，V1为滤液1体积(mL)，m为大孔树脂质量(g)。

图2 药材树脂比例

泄露曲线的绘制。预先装好D101大孔树脂柱(1 BV=15mL)，湿法上柱，吸取质量浓度为20.80 g/mL的上样液，以2 BV/h的流速进行动态吸附，分段接收流出液，并测定流出液中总皂苷的含量，绘制其泄露曲线。由图3可知，随着上样量的不断增加，流出液中总皂苷含量也随之增加，当上样量为0.67 BV(10 mL)时，总皂苷泄漏量较少，上样量达到1 BV(15 mL)时，总皂苷泄露量开始大幅度增加，即大孔吸附树脂达到动态吸附饱和状态，综合考虑工业大批量生产时树脂的重复使用以及树脂药材比例的影响，充分利用样品，故选取最大上样体积为0.67 BV。与药材树脂比例试验结果较为吻合，故确定浓度为20.80 g/mL的上样液体积为0.67 BV(10 mL)。

图3 泄露曲线(BV)

2.2.5 水洗体积考察 处理好D101型大孔树脂柱(1 BV=15 mL)，湿法上柱，吸取皂苷质量浓度为20.80 g/mL上样液0.67 BV，以适宜流速进行动态吸附，加入蒸馏水以适当流速去除杂质，并观察颜色变化，结果显示蒸馏水洗至3.33 BV时，洗脱液接近无色，故确定水洗体积是3.33 BV。

2.2.6 洗脱溶剂考察 装4根D101大孔树脂柱(1 BV=15 mL)，分别吸取皂苷质量浓度为20.80 mg/mL上样液0.67 BV，以适宜流速上柱，加3.33 BV水洗脱树脂柱除杂，合并流出液，测定流出液中总皂苷含量。分别用7 BV 30%、50%、70%、95%的乙醇以适宜流速进行洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中总皂苷含量，并计算解析率。由图4可知，随着乙醇浓度增大，总皂苷解析率先升高后降低，当乙醇浓度为70%时解析率最高，故最佳洗脱溶剂为70%乙醇。

图4 乙醇浓度对解析率的影响(%)

2.2.7 洗脱体积考察 预处理好D101型大孔树脂柱(1 BV=15 mL)，湿法上柱，量取总皂苷浓度为20.80 mg/mL上样液0.67 BV，以适宜流速上柱，加3.33 BV水洗脱树脂柱除杂，合并吸附滤液和水洗液，测定流出液中总皂苷含量。再用体积分数为70%的乙醇8.33 BV以适宜流速进行洗脱，分段收集洗脱液，测定洗脱液中总皂苷含量，绘制洗脱曲线。由图5可知，随着洗脱剂用量增加，总皂苷质量浓度随之降低，洗脱剂为6.67 BV时，总皂苷含量极少，综合考虑，确定洗脱体积为6.67 BV。

图5 洗脱体积对质量浓度的影响(BV)

2.2.8 洗脱流速考察 装4根D101大孔树脂柱(1 BV=15 mL)，湿法上柱，分别吸取总皂苷浓度为20.80 mg/mL上样液0.67BV，以适宜流速上柱，加3.33 BV水洗脱树脂柱除杂，合并吸附滤液和水洗液，测定流出液中总皂苷含量。再用体积分数为70%的乙醇6.67 BV以48 BV/h、12 BV/h、4 BV/h、2 BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中总皂苷含量，并计算解析率。由图6可知，随着流速的增大，总皂苷解析率逐渐降低，洗脱流速为2 BV/h的解吸率最高，故选最佳的洗脱流速为2 BV/h。

图6 洗脱流速对解析率的影响(mL/h)

2.3 最佳工艺条件验证

装3根相同规格、相同柱体积的D101型树脂柱(170 mL)，分别加入0.59 BV总皂苷浓度为20.80 mg/mL的上样液，以适宜流速进行动态吸附，先以2 BV/h的洗脱流速水洗2.94 BV，于550 nm处测定其吸光度，再用5.89 BV的70%乙醇洗脱，收集70%醇洗脱液，于550 nm处测定其吸光度，计算总皂苷的吸附率和解吸率。减压回收溶剂，干燥后称重，得到富集物，计算总皂苷纯度，具体结果见表3。由表3可知，最优纯化工艺条件下，吸附率为73.40%，解吸率为76.91%，富集物中黑骨藤总皂苷含量达到32.17%，比原药液(21.04%)有明显提高。

表3 纯化工艺验证结果 (%)

3 讨论

本实验考察了吸附时间对吸附率和解析率的影响，发现吸附24 h后，吸附率和解吸率都有所提高，故确定上样时，吸附24 h后再洗脱。在考察最大上样量时，本实验采用了绘制泄露曲线和考察药材树脂比例2种方法。绘制泄露曲线法：随着上样量的不断增加，总皂苷的泄漏量液也随之增加，当上样液达到0.67 BV时，其泄露量开始明显增大，此外，由于树脂柱下面部分所含水分较多，导致树脂柱中残留少量药液未流出，仍有部分皂苷未被大孔树脂吸附，故不能准确确定最大上样量。为确保上样体积选取的准确性，同时考察了药材与树脂比例因素，平行4份，当上样液为20 mL时，药材与树脂比例为20.97 mg/g树脂，即0.5 g原药材。通过对以上2种方法的比较，发现选取绘制泄露曲线确定上样体积有一定的局限性，可能会影响目标产物的吸附率和解吸能力，相比而言，药材与树脂比例试验得到的数据更加准确、直接。

大孔吸附树脂在装柱时应注意应尽量去除气泡，以免柱子出现断层现象；加入上样液时，应缓缓加入，防止树脂被药液冲起而影响分离效果。在考察不同上样浓度对树脂吸附率的影响时发现，上样浓度越高，吸附率越高，当上样浓度达到20.80 mg/mL时，吸附率是最高的，而流速的问题对其也有很大影响，当流速越大，加之上样浓度越低，则大部分有效成分会随之流失，进而导致树脂的吸附率降低，而本实验中单因素考察时所用上样浓度为20.80 mg/mL，本身就比较浓，也相当于流速很慢，所以在整个实验中所述的适宜流速均很慢，且比较固定。

本实验具体工艺参数为：选用D101型号大孔吸附树脂装柱，上样吸附时间为24 h，采用70%乙醇6.67 BV进行洗脱，洗脱剂流速为2 BV/h。通过数据可以看出，纯化前黑骨藤总皂苷的纯度为21.04%，而纯化后的纯度为32.17%，比纯化前提高了11.3%。通过验证实验证实，该工艺路线稳定可行，可为黑骨藤的生产应用提供依据。