基于网络药理学的穿山龙治疗糖尿病足机制研究

肖 勇，闵晓俊，邵嘉楷，高章远致，冯心苑

(1.湖北中医药大学 第一临床学院，湖北 武汉 430061；2.湖北省中医院甲状腺疾病诊疗中心，湖北 武汉 430061)

糖尿病发病率逐年增高，糖尿病足的发病率也明显增加，并发糖尿病足溃疡患者死亡率达11%，因糖尿病足而截肢的患者死亡率也高达22%，糖尿病足已经成为糖尿病患者致死和致残的主要原因之一[1]。但目前糖尿病足的发病原因尚不明确，其治疗手段也较为单一，整体治疗原则仍然是以预防为主[2-6]。

中医在治疗糖尿病足的长期临床实践中取得了不错的临床疗效，其强调整体辨证与局部辨证相结合、辨病与辨证相结合，运用中药多活性成分的特点，通过多靶点、多通路发挥治疗作用[7]，其中传统中药穿山龙具有祛风除湿、舒筋通络、活血止痛的作用，各医家在运用其治疗风湿痹证、四肢麻木、血脉瘀滞等方面有较好的疗效与经验[8-11]；现代药理学研究也证实了穿山龙部分活性成分具有治疗糖尿病及其并发症的作用[12-17]，但其药效物质基础和作用机制尚不完全明确。网络药理学是医学、生物学、计算机科学、生物信息学等多学科基础与研究手段综合的结果，能够系统反映药物多成分对疾病的干预机制。本研究从网络药理学出发，从整体角度分析穿山龙治疗糖尿病足的分子机制，以期为后续研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 穿山龙化学成分获取

以“穿山龙、穿山薯蓣”为关键词，分别在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、台湾中医药资料(TCM Database@taiwan)、中医简化综合数据库(TCMSID)，并参考国内外文献，对穿山龙的化学成分进行搜集补充。将获得的成分进行命名规范除重并逐一输入Pubchem数据库，获得这些成分的分子结构，以*.mol的格式储存。

1.2 主要活性化合物筛选

基于Swiss ADME平台预测穿山龙化学成分的吸收度和类药性相关参数，将获得的*.sdf格式文件上传至Swisss ADME(http：//www.swissadme.ch/)平台，通过筛选得到穿山龙的活性成分。

1.3 主要活性化合物靶点预测

将筛选的活性成分的*.sdf格式文件导入Swiss Target Predition(http：//www.swisstargetprediction.ch/)平台，设置属性为“Homo sapoens”，搜集预测到的所有靶点，并对靶点进行除重。根据靶点实际目标的“Probility值”进行排名，选取中位数以上的靶点作为活性化合物靶点。

1.4 糖尿病足相关靶点搜集

以“diabetic foot”“diabetic foot disease”为关键词在Gene Card数据库(http：//www.genecards.org)检索与糖尿病足相关的靶点。并通过OMIM数据库(http：//www.omim.org)、TTD数据库(http：//bidd.nus.sg/group/cjttd)寻找糖尿病足相关疾病靶点进行补充。在Genecards数据库中，Score值越高则代表该靶点与疾病关系密切。根据经验，若靶点过多则设定Score大于中位数的目标靶点为糖尿病足潜在靶点，合并4个数据库的靶点并删除重复值，得到糖尿病足潜在靶点。应用Uniprot数据库对得到的成分靶点、疾病靶点名称进行规范化。通过R语言将药物活性靶点和疾病靶点取交集并绘制韦恩图，得到药物-疾病交集靶点。

1.5 药物-成分-靶点-疾病网络图构建

将获得的药物-疾病交集靶点与药物活性成分作用靶点相匹配，得到药物作用于疾病靶点的具体活性成分，并构建穿山龙治疗糖尿病足的药物-成分-靶点网络图。

1.6 蛋白相互作用网络构建

将药物-疾病交集靶点导入String平台(http：//string-db.org/)，设置物种为“Homo sapiens”，最小相互作用阈值为“Highest confidence”(>0.9)，其余设置均为默认设置，得到PPI网络，并通过Cytoscape 3.8.1中的MCODE插件对PPI网络进一步分析，得到潜在蛋白质功能模块，并通过分析其参与的生物学进程对其功能进行描述。

1.7 靶点功能与通路的富集分析

通过Metascape数据库(http：//Metascape.org)，设置物种为人类，对关键靶点的生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组成(CC)进行GO分析，并进行KEGG通路富集(P<0.05)，并将获得的结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 穿山龙治疗糖尿病足的活性成分筛选

通过检索中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)[18]、台湾中医药资料(TCM Database@taiwan)[19]、中医简化综合数据库(TCMSID)和文献检索相关文献[20-22]的方式，搜集到107种化学成分，将得到的所有化学成分进行除重规范并逐一输入Pubmed数据库，共检索到有明确结构的活性成分69种，并将获得活性成分以*.sdf格式文件储存。

将获得的*.sdf格式文件导入Swiss ADME平台[23]，设定胃肠吸收结果为“High”作为药物可以被吸收的条件，用于筛选具有较好的口服生物利用度的活性化合物；其次，设定Druglikeness 5种类药性预测(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)结果中有2个及2个以上为“Yes”的化合物为活性化合物，共得到满足条件的活性化合物30个。见表1。

2.2 穿山龙主要活性化合物潜在靶点预测

将满足条件的30个穿山龙活性化合物结构的*.sdf格式文件导入到Swiss Target Prediction[24]平台预测到潜在相关靶点1 115个。根据靶点实际目标的“Probility值”进行排名，选取中位数以上的靶点作为活性化合物靶点，共得到靶点889个，删除重复靶点获得457个。

表1 穿山龙化学成分及ADME筛选结果

续表1

2.3 糖尿病足相关靶点获取

通过Gene Card数据库检索到的疾病相关靶点，再结合OMIM、TTD数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，得到相关靶点4 553个。根据经验设定Score大于中位数的目标靶点为糖尿病足相关靶点，靶点最大值为108.61，最小值为0.17，中位数为3.51，故设定Score>3.51的靶点为糖尿病足的潜在靶点，最终得到相关靶点2 284个。

2.4 穿山龙治疗糖尿病足的主要成分及靶点分析

将筛选的穿山龙活性成分靶点与糖尿病足疾病靶点取交集，并通过R语言绘制韦恩图，得到穿山龙成分-糖尿病足疾病共同靶点194个，见图1。因穿山龙的30个主要活性成分中的Epistephanine、Deoxyvasicinone、Benzoic acid、Cyclo-(Ser-Tyr)、Betaine、Mono-p-coumaroyl glyceride、Monocrotaline、Norvaline、2-tridecanone活性成分作用靶点与糖尿病足疾病靶点无交集，故将其舍弃。共得到穿山龙治疗糖尿病足活性成分21个，其中成分5-(1-hydroxyethyl)-2，8-dihydroxy-1，7-dimethyl-9，10-dihydrophenanthrene作用于糖尿病足的靶点最多有55个，其余依次为Cyclo-(Leu-Tyr)有52个靶点；1-hydroxyethyl)-2，6-dihydroxy-1，7-dimethyl-9，10-dihydrophenanthrene有51个靶点；Juncusol有46个靶点；Episarsasapogenin有42个靶点；(2s)-5-methoxy flavan-7-ol有40个靶点。穿山龙治疗糖尿病足的成分中作用于靶点CDK1、ESR1的活性化合物最多各有10个，其余靶点依次为GSK3B、HSD11B1、ESR2各有9个，GABRB3有8个，CCNA2、MMP2、AR、SLC6A3各有7个，将以上药物、成分、共同靶点数据进行处理，得到每个成分作用的多个靶点数、每个靶点作用的多个成分数值，制成Network文件及Type文件，将得到的文件导入Cytoscape 3.8.1软件绘制药物-成分-疾病靶点网络关系图，见图2。图2中以药物、成分、靶点为3类节点(Node)，他们之间的相互关系分别用边(Edge)相连，节点的Degree值越大，则节点的大小越大、颜色越深，图中圆形代表药物及成分，三角形代表作用靶点通路。其主要成分编号、名称及作用靶点数见表2，其主要靶点名称、Uniprot ID、被作用的成分频次见表3。

图1 穿山龙-糖尿病足靶点韦恩图

图2 药物-成分-靶点网络

表2 穿山龙治疗糖尿病足的主要成分及靶点频次

2.5 穿山龙成分-糖尿病足靶点PPI网络构建

将成分-糖尿病足共同靶点提交至STRING 11.0平台，选择物种为人类，设置度值(Dgree)>0.9，隐藏游离节点，得到穿山龙靶点PPI网络，见图3。由于获得的PPI网络中蛋白质的作用是相互的，所以通常是无向图。将得到的PPI网络图导入Cytoscape 3.8.1中，运用其中的MCODE插件，通过分子复合物检测算法对互相作用关系进行分析，得到PPI网络中更具有生物学意义的子网即Module，见图4。

2.6 GO生物功能注释即KEGG通路富集分析

应用Metascape数据平台对穿山龙治疗糖尿病足相关靶点进行GO、KEGG等生物通路富集分析，并借助Bioinformatics平台对结果进行可视化。GO富集分析共得到3 006个条目，其中BP 2 637个条目，CC 157个条目，MF 212个条目；KEGG富集分析得到350个条目。根据P值选取前20个条目进行可视化分析，通路富集结果见图5。

表3 靶点、Uniprot ID及被作用频次

图3 穿山龙-糖尿病足靶点PPI网络

图4 PPI网络中的Module

图5 穿山龙主要成分潜在靶点富集分析

2.7 穿山龙成分-糖尿病足靶点-通路网络图构建

运用Cytoscape 3.8.1构建穿山龙成分-糖尿病足靶点-通路网络，见图6。通过Cytoscape 3.8.1中的Network Analyzer功能分析穿山龙治疗糖尿病足网络拓扑学参数，得到核心成分及核心靶点。

图6 穿山龙-糖尿病足靶点-通路网络

3 讨论

目前糖尿病足病的具体发病机制尚不完全明确，研究认为此病的发生可能与多元醇和肌醇的代谢异常、氧自由基的形成、神经营养障碍、轴突运输缺陷及非神经元结构和转运蛋白的酶促糖基化相关[25]。糖尿病足的治疗主要包括控制血糖、控制血压、降低血脂、营养神经、改善循环、抗氧化应激、抗炎镇痛等方式[26]，但这些治疗手段缺乏特异性。穿山龙可以通过改善胰岛素抵抗、增强胰岛素敏感性而发挥降血糖作用[27]，并且其所含的薯蓣皂苷成分还可以通过调节糖脂代谢、细胞凋亡、炎症和氧化应激的相关靶点来改善糖尿病并发症[28]。穿山龙所含的薯蓣皂苷可以通过改善糖尿病大鼠血清中致痛物质HA和5-HT的表达以减轻疼痛[29]，也可以抑制HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路来降低神经细胞的凋亡和炎性反应[30]。本研究对穿山龙作用于糖尿病足的相关活性成分进行分析，发现 5-(1-hydroxyethyl)-2，8-dihydroxy-1，7-dimethyl-9，10-dihydrophenanthrene(D21)、cyclo-(Leu-Tyr)(D13)、1-hydroxyethyl)-2，6-dihydroxy-1，7-dimethyl-9，10-dihydrophenanthrene(D20)、juncusol(D24)、episarsasapogenin(D9)等对应的糖尿病足的相关靶点最多，说明该成分可能是穿山龙治疗糖尿病足的重要成分，可以为后续研究提供理论依据。

在穿山龙成分-糖尿病足蛋白互作网络中，隐藏游离节点后共得到节点(Node)166个，边(Edge)818条，其中排名前5的蛋白包括PIK3CA、SRC、SHC1、STAT3、HRAS等，有研究表明PIK3CA的上调可能与糖尿病性心脏病的发生有关，通过失活PI3K/Akt信号通路靶向PIK3CA蛋白可能对糖尿病并发症中的心脏起保护作用[31]。并且JAK2/STAT3/SOCS轴可以通过介导与血管内皮细胞或单核细胞相关的炎症而促进糖尿病大血管并发症的发生[32]，因此穿山龙治疗糖尿病足的机制可能与以上蛋白通路相关。

由GO富集结果可知其中穿山龙参与的主要生物过程(BP)包括MAPK级联反应的正调控、肽基酪氨酸磷酸化、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、细胞对氮化合物的反应、血液循环、对氧化应激的反应、脂质代谢过程的调节等；主要细胞组成(CC)为受体复合物、细胞器外膜、溶泡、内吞小泡等；主要分子功能(MF)包括蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、核受体活性、胰岛素受体底物结合、热激蛋白结合等功能；KEGG信号通路包括Rap1信号通路、Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路、内分泌抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、胰岛素信号通路、胰岛素抵抗等。缺氧诱导因子(HIF)-1作为PI3K-Akt信号通路的关键下游蛋白，在缺氧条件下，HIF-1水平迅速增加，此外，PI3K-Akt还可以减少糖原的合成并增加糖酵解[33]，穿山龙可以通过调节PI3K-Akt通路改善糖尿病足远端血液循环及营养障碍。

本研究通过网络药理学方法筛选出穿山龙治疗糖尿病足的可能机制是中药穿山龙通过作用于CDK1、ESR1、GSK3B、HSD11B1、ESR2和GABRB3等相关靶点，通过Rap1 signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、Endocrine resistance、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、ErbB signaling pathway等相关通路发挥调节免疫、改善胰岛素抵抗、降低血糖、调节细胞周期、促进细胞凋亡等作用，从而达到治疗糖尿病足的目的。本研究结果可以为穿山龙治疗糖尿病足有效成分的研究开发和临床应用提供参考。