上皮性卵巢癌中Bax、Gal-3及GST-π表达与顺铂化疗耐药的关系*

王小玉 唐寅 孔佑虔 朱梦一

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

上皮性卵巢癌因起病隐匿、早期缺乏有效筛查手段及易在盆腔内散播和转移等原因，其病死率占女性生殖道恶性肿瘤首位[1]。该类患者约80%对铂类为基础的化疗敏感，但多数会出现复发和铂耐药。因此，上皮性卵巢癌的治疗效果一直无法完善，5年生存率一直徘徊在30%～40%，且90%以上患者死于原发性或继发性化疗耐药[2]。因此,明确耐药相关分子机制，寻找有效的耐药逆转剂和治疗靶标，对提高上皮性卵巢癌化疗敏感性、逆转耐药与调整治疗方法具有重要意义[3]。目前针对临床标本的报道指出，细胞凋亡相关因子Bax、半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)及谷胱甘肽转移酶-π(Glutathione transferase,GST-π)等因子水平与甲状腺癌、膀胱癌、卵巢癌等恶性肿瘤化疗敏感性具有一定相关性，但体外实验及机制研究鲜为报道[4-5]。基于此，本研究通过观察上皮性卵巢癌中Bax、Gal-3及GST-π表达与顺铂化疗耐药的关系，探讨其可能机制，并为顺铂耐药的上皮性卵巢癌的治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年4月～2019年12月黑龙江中医药大学附属第一医院收治的94例上皮性卵巢癌患者(卵巢癌组)为研究对象,按对化疗是否敏感分为化疗敏感组(敏感组)58例和化疗耐药组(耐药组)36例。纳入标准：①均符合《妇产科学》第九版相关上皮性卵巢癌的诊断标准[6]。②未合并其他脏器恶性疾病。③既往无卵巢手术史。④均顺利完成本次研究，无中途退出者。排除标准：①临床资料缺损或丢失者。②术前进行放疗、化疗等治疗者。③过敏体质者。④心、脑、肝、肾等功能严重不全者。另选取同期进行健康体检的53例女性体检者作为对照组。本研究经医院医学伦理委员会批准通过，受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 Bax鼠抗人单克隆抗体，购自福州迈新生物技术公司；Gal-3鼠抗人单克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司；GST-π鼠抗人单克隆抗体，购自北京中山生物技术开发公司。链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)免疫组化超敏试剂盒、胰蛋白酶及二氨基联苯氨酶底物显色试剂盒，均购自福州迈新公司。

1.2.2 检测方法 标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，组织连续切片，厚度为4μm;脱蜡、水化，随后经3%双氧水消化内源性过氧化物酶。然后根据SP免疫组化染色法对VEGF-C、CCL21及Bmi-1蛋白进行检测，检测过程严格按照说明进行。一抗阴性对照使用PBS(磷酸盐缓冲液)进行代替。

1.2.3 结果判断 Bax表达于细胞质，Gal-3、GST-π表达于细胞核、细胞质中。根据阳性细胞百分比、染色强度判定[7]。①阳性标准为在细胞核或细胞浆内出现棕黄色或褐色颗粒。0分为无色，1分淡黄色，棕黄色2分，棕褐色3分。总积分：上述2项评分的乘积。阳性：总积分>4分。②阳性细胞率计算：从每张切片中随机选取5个高倍视野并计算、观察阳性细胞数，阳性细胞率=阳性细胞数/观察细胞数×100%。0分：无阳性细胞；1分：阳性细胞<10%；2分：10%～50%；3分：50%～75%；4分:>75%。总积分：上述2项评分的乘积。阳性：总积分>4分。

1.3 观察指标 ①比较卵巢癌组、对照组Bax、Gal-3及GST-π表达情况。②分析卵巢上皮性癌病理特征与Bax、Gal-3及GST-π的关系。③根据美国妇科肿瘤学组(GOG)建议分型[7]：初次采用顺铂药为基础的化疗并获得缓解，停药超过6个月出现复发灶者纳入敏感组；将初次治疗有效，但病灶完成化疗相对较短的时间即6个月内复发者纳入耐药组。分析两组Bax、Gal-3及GST-π表达情况，并分析上述因子预测上皮性卵巢癌患者顺铂化疗耐药的价值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计数资料通过率(%)表示，并采用2检验，采用ROC曲线分析Bax、Gal-3及GST-π对顺铂化疗耐药的预测价值。检验水准为α=0.05,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌组与对照组一般资料比较 纳入的94例上皮性卵巢癌患者患者，均为初次治疗，术后辅以顺铂的联合化疗；患者年龄34～67岁，平均年龄(45.54±10.52)岁；临床分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期16例，Ⅲ期36例，Ⅳ期23例；病理类型：浆液性癌43例，黏液性癌31例，子宫内膜样10例，透明细胞癌10例；伴淋巴结转移者60例(盆腔淋巴结45例和腹主动脉旁淋巴结15例)；病理分级G122例，G228例，G344例。对照组年龄33～66岁，平均年龄为(44.56±9.54)岁。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 两组Bax、Gal-3及GST-π表达情况比较 卵巢癌组Bax、Gal-3及GST-π阳性表达率均高于对照组 (P<0.05)。见表1。

表1 卵巢癌组、对照组Bax、Gal-3及GST-π表达情况比较[n (×10-2)]Table 1 Comparison on Bax,Gal-3 and GST-π expression in ovarian cancer group and control group

2.3 Bax、Gal-3及GST-π表达与上皮性卵巢癌病理特征的关系 Bax阳性表达率与上皮性卵巢癌患者临床分期、病理分级具有显著相关性 (P<0.05)；Gal-3阳性表达率与上皮性卵巢癌患者临床分期、淋巴结转移及病理分级具有显著相关性 (P<0.05)；GST-π阳性表达率仅与患者病理分级具有相关性 (P<0.05)。见表2。

表2 Bax、Gal-3及GST-π表达与上皮性卵巢癌病理特征的关系[n (×10-2)]Table 2 The relationship between the expressions of Bax,Gal-3 and GST-π and the pathological characteristics of epithelial ovarian cancer

2.4 敏感组、耐药组Bax、Gal-3及GST-π表达情况 卵巢癌患者中敏感组Bax阳性表达率显著高于耐药组，Gal-3、GST-π阳性表达率显著低于耐药组，组间比较差异均具有统计学意义 (P<0.05)。见表3。

表3 敏感组、耐药组Bax、Gal-3及GST-π表达情况[n (×10-2)]Table 3 Bax,Gal-3 and GST-π expressions in the sensitive group and drug-resistant groups

2.5 Bax、Gal-3及GST-π预测上皮性卵巢癌患者顺铂化疗耐药的价值 ROC结果显示，Bax、Gal-3及GST-π单项检测曲线下面积(AUC)分别为0.655、0.691、0.773,联合检测AUC为0.803,明显高于单独检测。见表4、图1。

表4 Bax、Gal-3及GST-π预测上皮性卵巢癌患者顺铂化疗耐药的价值Table 4 The value of Bax,Gal-3 and GST-π in predicting drug resistance of cisplatin chemotherapy in patients with epithelial ovarian cancer

图1 Bax、Gal-3及GST-π单项及联合预测曲线图Figure 1 The prediction curve of single Bax,Gal-3 and GST-π and combined detection of them

3 讨论

目前临床上治疗上皮性卵巢癌的标准治疗方案为肿瘤细胞减灭术结合铂类为基础的辅助化疗。综合治疗后，多数患者会出现复发或进一步转移扩散，晚期上皮性卵巢癌患者5年生存率不超过30%[8]。以顺铂为代表的铂类是上皮性卵巢癌化疗的一线药物，顺铂进入细胞后，解离形成带正电荷的水合铂，与胞内亲质子的分子结合，包括 DNA、RNA 和蛋白质，进而引发细胞程序性死亡。而对铂类药物耐药是导致肿瘤未控、复发等治疗失败的重要原因之一[9]。因此寻求可逆转卵巢癌铂耐药的分子靶点是综合治疗上皮性卵巢癌的重要方向与目标之一。

Bax是促凋亡类蛋白的典型代表，Mazumder[10]研究表明，Bax在乳腺癌、直肠癌等恶性肿瘤的凋亡调解中发挥着重要作用。同时国外有报道在已建立的细胞系和原发性卵巢癌细胞中发现Bax基因过度表达将增强化疗药物诱导的细胞毒作用，提示上皮性卵巢肿瘤中Bax基因与化疗药物耐药性及预后有关[11-12]。Gal-3在人类基因组中由单个基因 LGALS3 编码位于14号染色体，是半乳糖凝聚素家庭中唯一的嵌合型代表[13]。Gal-3主要存在于细胞质中，在多种生物行为中起重要作用，如胚胎形成、生长、细胞增值、分化、细胞周期进展、凋亡等。Krishna[14]等报道在卵巢透明细胞癌细胞中沉默Gal-3表达后，由顺铂诱导的细胞凋亡明显增加，沉默效应消除后，诱导凋亡效应也随之减弱。GST是一种多功能药物代谢酶，参与细胞内解毒，可分为μ、α、θ、π及膜结合微粒5种类型，其中以GST-π与肿瘤细胞的多药耐药关系最为密切[15]。GST-π通过催化方式降解药物及酶结合方式将抗癌药物从体内排出，从而造成肿瘤细胞耐药，GST-π高表达是导致宫颈癌对铂类耐药的主要原因[16]。

本研究结果显示，Bax、Gal-3及GST-π在卵巢癌组织中的阳性表达率显著高于正常卵巢组织，且上述因子表达与肿瘤分期、病理分级及淋巴结转移具有一定关系，提示Bax、Gal-3及GST-π表达异常参与上皮性卵巢癌的发生、发展，可作为预测上皮性卵巢癌发生、发展过程中的重要标记物。此外，本研究发现，化疗耐药组中Bax呈低表达，Gal-3、GST-π呈高表达，提示上皮性卵巢癌组织中Bax、Gal-3及GST-π的表达与顺铂化疗疗效有关，Bax蛋白高表达提示化疗敏感，Gal-3、GST-π高表达提示化疗耐药。这可能与Bax蛋白升高时，加速了肿瘤细胞凋亡，与化疗药物的诱导细胞凋亡发生协同作用，故而对化疗敏感；而Gal-3、GST-π蛋白表达升高时，肿瘤细胞凋亡受到抑制，化疗药物很难通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，从而产生耐药[17]。另外，本研究通过ROC曲线分析发现，联合检测Bax、Gal-3及GST-π可提高上皮性卵巢癌患者顺铂化疗耐药的预测价值，提示与单一检测相比，联合检测效能更佳。

4 结论

Bax低表达、Gal-3及GST-π高表达均与上皮性卵巢癌患者顺铂化疗耐药相关，三者表达变化相互作用引起上皮性卵巢癌肿瘤多药耐药产生，最终导致化疗失败。因此，联合检测上述因子可预测患者化疗敏感性，获取较为全面的耐药信息，为临床化疗药物选择及疗效预测提供参考，尤其利于制定个体化的化疗方案，同时针对不同的耐药机制采用可能的耐药逆转治疗，促使患者更大获益。