LncRNA NPSR1-AS1在胃癌中的表达及作用机制

谢文杰,张鹤腾,唐银炳,陆佳伟,侯雯跻,周晓东,徐颖,张文波,于强,邹晨

(江苏大学附属人民医院a.普外科,b.中心实验室,c.神经外科,江苏镇江 212002)

据文献报道,在消化系统肿瘤中胃癌的发病率位居前列，是癌症患者死亡的主要原因之一[1]。LncRNA是长度大于200个核苷酸，缺乏蛋白质编码能力，与DNA、RNA和蛋白质相互作用，在表观遗传、转录及转录后水平上发挥关键的调控作用[2]。LncRNA NPSR1-AS1主要定位于7号染色体p14.3。Huang等[3]从The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库中分析了149例肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者的LncRNA表达模式以及相关的临床数据，其认为NPSR1-AS1与HCC的预后相关，并有望成为HCC治疗的靶标。此外，He等[4]根据微阵列分析，认为NPSR1-AS1是一种缺氧反应性LncRNA；缺氧诱导的NPSR1-AS1可能通过调节MAPK/ERK途径来促进HCC细胞的增殖和糖酵解，并有望用于HCC治疗[4]。为研究NPSR1-AS1与胃癌的关系，本研究检测了NPSR1-AS1在胃癌患者组织及血浆中的表达情况，结合患者的临床病理资料，分析其与NPSR1-AS1表达量的关系，同时，还进行了细胞功能学试验及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肿瘤相关基因的表达，并进一步研究其作用机制，以期为临床诊疗提供实验依据。

1 资料和方法

1.1研究对象 收集2015年4月至2019年7月于江苏大学附属人民医院普外科接受手术治疗的86例胃腺癌患者的癌组织及相应的癌旁组织(距肿瘤边缘>5 cm)。女性24例，男性62例，年龄47～82岁，中位年龄68岁；肿瘤最大径>5 cm者22例，≤5 cm者64例；淋巴结转移阴性者(N0)38例，阳性者(N1-3)48例；胃癌TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期46例。纳入标准：(1)经病理科2名副主任医师联合诊断为胃腺癌；(2)所有患者术前均未接受放疗、化疗及其他非手术的抑癌疗法。排除标准：(1)合并其他肿瘤者；(2)有高血压、糖尿病、心脏病、肺部疾病和免疫系统疾病者。随机选取上述胃癌患者中的21例(男性14例，女性7例，年龄52～76岁)，检测血浆中NPSR1-AS1的表达水平。另外，随机收集在本院体检中心体检的21例(男性12例，女性9例，年龄27～46岁)体检健康者的血浆标本作为对照组。本研究经江苏大学附属人民医院伦理委员会的批准(批准文号：K20180016Y)。所有受试者及家属均知情同意。

1.2细胞系、试剂和仪器 胃癌细胞系AGS(中国科学院上海细胞库)。RNA提取试剂(Trizol，美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒(美国Sigma公司)，转染试剂Lipofectamine 2000(日本TaKaRa公司)，siRNA-NPSR1-AS1小干扰RNA、阴性对照小干扰 RNA(上海吉玛公司)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(江苏碧云天公司)。Transwell小室(美国Corning公司)，Matrigel基质胶(美国BD公司)，NanoDrop 1000微量紫外可见分光光度计(德国 Eppendorf公司)，CFX96荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.3RNA提取及RT-qPCR 采用苯酚-氯仿抽提法，按照Trizol试剂说明书从胃癌组织、血浆及胃癌细胞中提取总RNA，并用NanoDrop 1000微量紫外可见分光光度计检测其浓度和纯度，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值为1.9～2.1的样本用于后续试验。按逆转录试剂盒说明书将RNA样本逆转录为cDNA，样本置于-20 ℃保存。根据GenBank中的基因序列号，用Primer Premier 5.0软件设计引物，并送上海生工公司合成(表1)。根据SYBRRT-RT-qPCR Mixture试剂说明书配制体系，细胞、组织和血浆RT-qPCR体系：10 μL 2×PCR Mixture，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，1 μL模板cDNA，8.2 μL ddH2O。将上述体系置于ABI荧光定量PCR仪中检测，循环参数：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，共40次循环。72 ℃时采集荧光信号，使用7500 System Software-SDS 2.2软件进行熔解曲线分析。细胞和组织以β-actin为内参基因，血浆以U6为内参基因。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4细胞转染 复苏胃癌AGS细胞，取1×105个细胞(每孔200 μL)铺于12孔细胞培养板中，置于细胞培养箱(37 ℃、5% CO2)中培养，待其细胞密度达60%～80%时转染。按照Lipofectamine 2000说明书操作，用无血清培养基配制转染试剂及si-RNA工作液，试验设2组，分别为：si-NPSR1-AS1组(50 μL无血清的 RPMI 1640 培养液+2 μL Lipofectamine2000+2 μL si-NPSR1-AS1)；si-NC组(50 μL无血清的 RPMI 1640培养液+2 μL Lipofectamine2000+ 2 μL si-NC)，分别混匀静置20 min后进行转染，4～6 h后更换为完全培养基继续培养。

1.5细胞生长曲线 取上述转染48 h后的AGS细胞(si-NPSR1-AS1组和si-NC组)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，重悬并计数，以每孔1×104个的细胞密度接种于12孔细胞培养板，每组设置6个复孔。置于细胞培养箱(37 ℃、5% CO2)中培养，培养基每3 d更换1次，每隔24 h在光学显微镜下拍照并计数，结果取均值，连续计数5 d，根据细胞数量绘制生长曲线，并计算细胞增殖能力。

1.6平板克隆形成试验 取上述转染48 h后的AGS细胞(si-NPSR1-AS1组和si-NC 组)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，重悬并计数，以每孔1×103个的细胞密度接种于6孔细胞培养板中，置于细胞培养箱(37 ℃、5% CO2)中培养，培养基每3 d更换1次。在培养后的第10天，将细胞用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.5%结晶紫避光染色15 min，再用PBS清洗2～3次，待自然风干后，光学显微镜下观察并计数大于30个细胞、集落大小为0.4～1.0 mm的克隆。

1.7Transwell 细胞迁移和侵袭试验

1.7.1迁移试验 取转染48 h后的AGS细胞(si-NPSR1-AS1组和si-NC 组)，2.5 g/L胰蛋白酶消化，加入无血清培养基重悬并计数，调整细胞浓度为1×105/mL。然后以每孔200 μL接种于Transwell小室上室，下室中每孔加入750 μL完全培养基。培养24 h后，4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.5%结晶紫染色15 min，棉签擦去上室面残余细胞，用荧光显微镜拍照并随机计数10个视野(×100)的细胞数, 结果取均值。

1.7.2侵袭试验 取无血清培养基44 μL和Matrigel 6 μL混合稀释，滴入Transwell小室中包被上室膜，然后置于24孔细胞培养板中，置于培养箱温育4 h。其余步骤同迁移试验。

1.8细胞凋亡试验 取上述转染48 h后的AGS细胞(si-NPSR1-AS1组和si-NC 组)，1×Binding buffer重悬细胞，计数并加入PBS，调整细胞浓度为2×105/mL，依次加入10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI混合，避光静置15 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)。

1.9统计学分析 数据均采用SPSS 23.0软件进行统计分析，GraphPad Prism 7.0软件分析制图。所有试验均独立重复3次，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。计数资料采用χ2检验。生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1NPSR1-AS1在胃癌组织及血浆中的表达 RT-qPCR结果显示，86例胃癌组织标本中NPSR1-AS1的相对表达量(3.98±0.36)显著高于癌旁组织(2.78±0.31)，差异具有统计学意义(t=2.51，P<0.05)。而21例胃癌患者血浆中NPSR1-AS1的相对表达量(4.35±0.39)亦显著高于21例体检健康者(2.51±0.50),差异具有统计学意义(t=2.89，P<0.01)。

2.2NPSR1-AS1在胃癌组织及血浆中的临床应用价值 NPSR1-AS1在86例胃癌组织中相对表达量的中位数为0.913，以此为界将胃癌患者分为高表达组(n=43)和低表达组(n=43)。结合临床病理资料，分析其与NPSR1-AS1表达量的关系，结果显示NPSR1-AS1高表达与肿瘤大小(t=11.02，P<0.01)、淋巴结转移(t=2.30，P<0.05)、肿瘤血管或神经侵袭(t=3.09，P<0.01)和TNM分期(t=3.55，P<0.01)密切相关。而与性别、年龄、是否吸烟、饮酒等无显著相关性(表2)。Kaplan-Meier分析表明，NPSR1-AS1高表达组患者的生存率明显低于低表达组(HR=2.58,95%CI:1.38～4.71,P<0.05,图1A)。胃癌患者血浆NPSR1-AS1水平诊断胃癌的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.696，95%CI为0.534～0.858，当cut-off值为9.52时，特异性为90.5%，敏感性为47.6%。见图1B。

注：A，NPSR1-AS1表达与胃癌患者生存率之间的相关性；B，血浆NPSR1-AS1表达水平的ROC曲线。

表2 胃癌患者组织中NPSR1-AS1的表达与临床病理参数的关系

2.3NPSR1-AS1敲减后对AGS细胞生物学行为的影响 转染AGS细胞48 h后经RT-qPCR结果证实，siRNA的敲减效率满意，其表达量(1.03±0.01)与对照组(0.57±0.02)相比，下降了54.5%(t=18.92，P<0.05，图2A)。细胞生长曲线及平板克隆形成试验结果表明，NPSR1-AS1敲减后能抑制AGS细胞的增殖能力(t=2.789，P<0.05，图2B；t=14.00，P<0.05，图2C)。Transwell迁移和侵袭试验结果表明，NPSR1-AS1敲减后能抑制AGS细胞的迁移及侵袭能力(t=25.45，P<0.05，图2D)。流式细胞术检测结果显示，si-NPSR1-AS1凋亡(早期凋亡+晚期凋亡)比例为9.43%，明显高于si-NC组的5.22%(t=21.45，P<0.001，图2E)，表明NPSR1-AS1敲减可诱导AGS细胞的凋亡。

注：A，NPSR1-AS1敲减后在胃癌细胞中的表达水平；B、C,细胞生长曲线及平板克隆试验检测NPSR1-AS1敲减后对AGS细胞增殖能力的影响；D，Transwell试验检测 NPSR1-AS1敲减后对AGS细胞迁移及侵袭能力的影响；E，流式细胞术检测NPSR1-AS1敲减后对AGS细胞凋亡的影响。**，P<0.01；***，P<0.001。

2.4NPSR1-AS1敲减后对肿瘤相关基因表达的影响 NPSR1-AS1敲减后，RT-qPCR检测肿瘤相关基因结果显示，与对照组相比，GSK-3β和E-cadherin的表达量(分别为1.86±0.05、1.59±0.06)明显上调(t分别为16.15和10.17,P均<0.01)，而β-catenin、N-cadherin、Snail和MMP2的表达量(分别为0.71±0.05、0.70±0.08、0.39±0.07、0.23±0.04)显著下调(t分别为4.869、3.77和9.372,P均<0.01)。

3 讨论

研究发现，LncRNA可通过调控胃癌细胞增殖、迁移和凋亡等多种生物学行为，直接或间接干扰基因表达，在胃癌的发生、发展及预后中发挥重要作用[5]。本课题组发现的LINC01225[6]在胃癌组织中高表达，并促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移和上皮-间质转化(EMT)过程。Yang等[7]发现，LINC00665在胃癌中的表达下调，在胃癌进展过程中发挥抑制胃癌细胞的增殖并诱导其凋亡的作用。目前关于NPSR1-AS1的研究甚少，至今还未证实其在胃癌中的作用机制。为了探讨NPSR1-AS1在胃癌中是否发挥促癌作用，本研究发现NPSR1-AS1在胃癌患者组织及血浆中的表达水平明显升高，其高表达与胃癌患者肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤血管或神经侵袭和TNM分期显著相关，并且高表达患者的术后总生存率明显降低，表明NPSR1-AS1在胃癌中发挥着促癌作用并导致其不良预后。笔者通过进一步的细胞功能试验发现，NPSR1-AS1可促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，表明其能够促进胃癌细胞的恶性生物学行为。

有学者发现，LncRNA可以通过靶向不同的分子标志物直接或间接地调节EMT过程，从而发挥促肿瘤作用[8]。而NPSR1-AS1能否也通过EMT实现这一过程目前尚不清楚。本研究发现，NPSR1-AS1敲减后GSK-3β和E-cadherin的表达上调，而β-catenin、N-cadherin、Snail和MMP2的表达下调，EMT相关基因变化明显。有文献显示，GSK-3β是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，在多种细胞活动中起关键作用，如细胞增殖、分化、凋亡和细胞周期等[9]。在多个信号通路中，如Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、Hedgehog、Notch等，GSK-3β均具有重要的中心枢纽作用，进而调控疾病的进展[10]。Wnt/β-catenin信号通路在EMT启动过程中发挥重要的调控作用，该信号通路活化后可以通过抑制GSK-3β的活性,致使β-catenin不能被GSK-3β磷酸化，导致游离β-catenin大量入核，而β-catenin在核内可以作为转录因子的亚单位,从而诱导EMT的转录因子表达以激活EMT过程。相反，GSK-3β过表达后可以抑制EMT过程[11]。本研究结果证实，NPSR1-AS1敲减后GSK-3β水平上调，从而抑制了β-catenin及EMT信号。Zheng等[12]发现LncRNA MALAT1可以作为GSK-3β负调节剂，抑制GSK-3β表达以降低β-catenin活性，从而影响结肠癌细胞的恶性行为。因此，笔者推测NPSR1-AS1可能通过Wnt/β-catenin信号通路的激活，刺激几种与EMT相关的转录因子，从而促进EMT过程。

本课题组在前期实验发现，NPSR1-AS1在胃癌患者组织及血浆中的表达水平升高，且与胃癌的发生和转移相关，本研究进一步探讨了NPSR1-AS1对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，但未探究细胞周期等其他生物学行为的影响。此外，NPSR1-AS1可能通过调节GSK-3β的表达水平，从而调控Wnt/β-catenin信号通路以诱导肿瘤的EMT过程，但尚缺乏相关实验进一步证明。在后续研究中，本课题组将进一步研究NPSR1-AS1如何调控GSK-3β的表达来影响胃癌细胞生物学行为的具体机制，以期为寻找新的胃癌治疗靶标提供更多的实验依据。