FXYD3在宫颈鳞癌患者组织中的表达及与临床病理参数的关系

马学玲，蔡海瑜，车艳红，刘星烁

(郑州市妇幼保健院a.妇科，b.妇科肿瘤病区，郑州 450052)

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，以宫颈鳞癌较为多发，近来发病呈年轻化趋势，危害严重[1]。早期确诊患者的5年生存率可达90%，但晚期多发生浸润、转移，患者预后差，Ⅳ期患者的5年生存率不足20%[2]。宫颈癌发病机制复杂，探究与发病机制相关的分子标志物对宫颈癌的病情监测具有重要意义。FXYD3蛋白(domain-containing ion transport regulator3 precursor)是FXYD蛋白质家族成员，以脯氨酸-苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸(PFXYD)而得名，又称为乳腺肿瘤标志物(MAT-8)，其可通过调节Na+-K+泵，参与细胞内环境代谢及稳态调节。研究发现，FXYD3在乳腺癌[3]、前列腺癌[4]等多种癌症中的表达上调，并与肿瘤恶性程度呈正相关。然而，关于FXYD3在宫颈鳞癌中表达情况的报道少见。虽然不同肿瘤的异质性极大的影响了相关肿瘤分子标志物的表达、患者治疗、预后及复发等，但不同肿瘤之间亦存在相似性，研究肿瘤异质性及相似性可加深对肿瘤发生、发展机制的认知[5]。因此，本研究选取FXYD3基因为研究对象，通过生物信息学数据库及免疫组化染色法分析FXYD3在正常宫颈组织及宫颈鳞癌组织中的表达情况，并初步探讨其与宫颈鳞癌患者临床病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2015年9月至2018年1月于郑州市妇幼保健院妇科收治的65例宫颈鳞癌患者癌组织标本，年龄(46.92±10.35)岁，肿瘤临床(FIGO)分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期32例，Ⅲ期13例，Ⅳ期5例；病理分级：Ⅰ级12例，Ⅱ级39例，Ⅲ级14例；淋巴结转移者26例，未转移者39例。纳入标准：(1)符合国际妇产科联盟(FIGO)宫颈鳞癌诊断标准[6]；(2)均行手术切除，术前均未进行放化疗等抗肿瘤治疗，术后均经组织病理学证实为宫颈鳞癌；(3)临床资料完整。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)合并基础性疾病或慢性感染性疾病者。另取同期50例本院保存的因子宫肌瘤行子宫全切术的正常宫颈组织标本作为对照组，年龄(46.41±11.08)岁，均经超声和病理检查确诊为子宫肌瘤[7]。本研究通过郑州市妇幼保健院医学伦理委员会审核批准[伦理批文：2015-(伦)009)]。患者出院后通过门诊复查、电话等方式对患者进行随访，记录患者生存时间(overall survival，OS)。本次随访截止日期为2020年12月。

1.2仪器与试剂 NanoDrop 2000c 超微量紫外分光光度计、905-ULT超低温冰箱(美国Thermo Fisher公司)，CFX96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。RNA提取试剂盒(北京天根公司)，反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，兔抗人FXYD3多克隆抗体、生物素标记的羊抗兔IgG二抗(英国Abcam公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司)。

1.3方法

1.3.1数据库挖掘分析 使用TCGA门户网站的UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)深入分析31种癌症类型的RNA测序数据及临床数据。从TCGA数据库(https://www.cancer.gov)下载宫颈鳞癌对应的mRNA表达RNASeq数据及临床数据。GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析来自TCGA和GTEX数据库中样本的RNA测序表达数据。下载GTEX数据库(https://commonfund.nih.gov/gtex)中正常宫颈组织的RNA Seq数据及临床数据，基于以上2种数据库，筛选存在FXYD3mRNA表达的宫颈鳞癌组织和正常宫颈组织样本，分析FXYD3在宫颈鳞癌(CESC)组织及正常宫颈组织中的表达差异。

1.3.2RNA提取及逆转录反应 按照RNA提取试剂盒说明书对宫颈鳞癌组织及正常宫颈组织标本(各60 mg)中的总RNA进行提取。NanoDrop 2000c 分光光度计检测RNA浓度，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值在1.8～2.0间的样本，置于-80 ℃保存。按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，置于-20 ℃保存。

1.3.3引物设计及实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 参照GenBank中各基因的序列号(FXYD3序列号为NC_000019.10、GAPDH序列号为NC_000012.12)，引物设计参照文献[8]，并由上海生工公司合成。FXYD3上游引物序列:5′-CCTGTCCTGGACGCCAAT-3′，下游引物序列:5′-GAGGCTGTGCCAGTCATAGTAGAA-3′，退火温度61 ℃，产物片段大小243 bp；GAPDH上游引物序列:5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物序列:5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。qRT-PCR反应体系共25 μL，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，cDNA(50 ng/μL)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，灭菌水8.5 μL。反应条件：预变性95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35个循环;72 ℃时采集荧光信号。以GAPDH为内参基因，2-ΔΔCt法计算FXYD3mRNA的相对表达量，计算公式：ΔΔCt=[(样本Ct目的基因-样本Ct内参基因)-(对照Ct目的基因-对照Ct内参基因)]。

1.3.4免疫组化染色法检测FXYD3蛋白表达 石蜡组织切片标本常规脱蜡至水，修复抗原，加入6%的正常山羊血清室温封闭30 min，加入50 μL兔抗人FXYD3多克隆抗体(1∶100稀释)4 ℃过夜，PBS洗涤3次，加入生物素标记的羊抗兔IgG二抗(1∶1 000稀释)，37 ℃温育1 h，PBS洗涤3次，DAB染色5 min，苏木素复染，盐酸酒精短暂分化后，脱水、透明、封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定:由2名资深病理医师采用双盲法分别对染色结果进行半定量评分。细胞质或核内呈黄色或棕色颗粒为阳性染色，采用免疫反应积分(IRS)法进行评分：染色强度(SI)积分，无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性染色细胞百分比(PP)积分，阴性记0分，PP 1%～10%记1分，PP 11%～50%记2分，PP 51%～75%记3分，PP 76%～100%记4分。IRS = SI积分×PP积分，IRS≥3为阳性，IRS<3为阴性。

1.3.5FXYD3共表达基因分析 基于cBioPortal数据库(https://www.cbioportal.org/)，选取相关系数r>0.3且P<0.05的基因。进一步将其导入Enrichr网站(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr)进行共表达基因的富集分析，选择显著相关通路，采用ImageGP(http://www.ehbio.com/Cloud_Platform/front/)在线软件进行信号通路富集分析，以气泡图形式呈现富集结果。

1.3.6FXYD3蛋白互作分析 STRING数据库(https://string-db.org/)是一种用于识别已知蛋白质和预测蛋白质之间相互作用的软件系统。基于STRING数据库对FXYD3蛋白进行蛋白质互作分析，绘制蛋白质互作网络图。

2 结果

2.1FXYD3在宫颈鳞癌组织及正常宫颈组织中的表达差异 UALCAN数据库中共分析了3例正常宫颈组织及305例宫颈鳞癌组织中FXYD3的表达，结果显示宫颈鳞癌组织中FXYD3的表达水平[8.921(8.287，9.400)]显著高于正常宫颈组织[0.995(0.346，5.837)]，差异有统计学意义(Z=-0.205，P<0.05)。进一步比较GEPIA数据库中13例正常宫颈组织[3.269(2.720，7.820)]及306例宫颈鳞癌组织[10.244(9.569，10.749)]FXYD3的表达量，结果显示宫颈鳞癌组织中FXYD3的表达水平亦显著高于正常宫颈组织(Z=-6.107，P<0.05)。

2.2FXYD3mRNA在宫颈鳞癌组织及正常宫颈组织中的表达 qRT-PCR结果显示，FXYD3mRNA在50例正常宫颈组织中的表达量为1.00±0.00，在65例宫颈鳞癌组织中的表达量为1.68±0.32，FXYD3mRNA在宫颈鳞癌组织中的表达量显著高于正常宫颈组织(t=15.011，P<0.05)。

2.3FXYD3蛋白在宫颈鳞癌组织及正常宫颈组织中的表达 免疫组化染色结果显示，FXYD3蛋白主要定位于细胞质或(和)细胞膜上。宫颈鳞癌组织中FXYD3阳性表达率为63.08%(41/65)，显著高于正常宫颈组织的28.00%(14/50)，差异有统计学意义(χ2=13.935，P<0.05)。

2.4FXYD3表达与宫颈鳞癌患者临床病理参数的关系 基于UALCAN数据库分析FXYD3与宫颈鳞癌患者临床病理参数的关系，结果显示FXYD3在不同组织类型中的表达差异有统计学意义(P<0.05，图1E)，在不同年龄、体重、种族、癌症分期、肿瘤分级、淋巴结转移类型中的表达差异无统计学意义(P>0.05,图1A～F)。本研究基于选取病例中FXYD3的表达情况，分析其与宫颈癌患者临床病理参数的关系，结果显示FXYD3蛋白的表达与年龄、病理分级均无关(P>0.05)，而与组织类型、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。见表1。

注：A，不同年龄；B，不同体重；C，不同种族；D，不同癌症分期；E，不同组织类型；F，不同肿瘤分级；G，不同淋巴结转移。

表1 FXYD3表达与宫颈鳞癌患者临床病理参数的关系[n(%)]

2.5FXYD3蛋白表达与宫颈鳞癌患者预后的关系 FXYD3蛋白阳性表达患者的平均生存时间(OS)显著低于阴性表达患者(38.12个月 vs 53.56个月，χ2=5.485，P=0.019)。

2.6FXYD3蛋白互作共表达分析 通过STRING网站在线绘制FXYD3蛋白互作网络图，根据相关性评分分析结果显示，相关性较强的前5个蛋白质分别为ATP1B1、ATP1B2、ATP1B3、ATP1A1、ATP1A2(图2)。

图2 FXYD3蛋白互作网络图

2.7FXYD3共表达基因通路富集分析 通过cBioPortal数据库，预测分析出417个与FXYD3共表达基因，表2为与FXYD3基因相关性较强的前5个基因。将共表达基因输入Enrichr网站进行通路富集分析，选择有显著差异的前20条，采用ImageGP在线网站绘制气泡图(图3)，结果显示，FXYD3共表达基因富集到的主要通路包括T细胞受体、B细胞受体、白细胞介素-17、趋化因子信号通路，氧化应激信号通路，非小细胞肺癌、膀胱癌等癌症信号通路，蛋白质水解、核黄素代谢、核酸合成代谢等信号通路。

表2 FXYD3基因共表达分析基因

注：气泡大小代表基因数量，气泡颜色由红色至蓝色表示显著性差异的P值逐渐减小。

3 讨论

FXYD3定位于人类染色体19q13.11-q13.12，是最早在家鼠的乳腺癌组织中发现的一种分子量(Mr)为8 000的单跨膜蛋白质，其可通过调节Na+-K+-ATP酶改变其对Na+、K+的亲和力，进而确保机体正常组织功能的运转[9]。本研究首先采用数据库统计分析FXYD3基因在正常宫颈组织及宫颈鳞癌组织中的差异表达情况，UALCAN数据库、GEPIA数据库中的统计结果均显示，宫颈鳞癌组织中FXYD3基因的表达水平显著高于正常宫颈组织，提示FXYD3基因可能起促癌基因作用。为进一步验证数据库统计结果，本研究采用qRT-PCR和免疫组化染色法检测65例宫颈鳞癌组织标本及50例正常宫颈组织标本中FXYD3mRNA及FXYD3蛋白的表达水平，结果显示FXYD3mRNA在宫颈鳞癌组织中的相对表达量及FXYD3蛋白阳性表达率均显著高于正常宫颈组织，与UALCAN、GEPIA数据库统计结果一致，提示FXYD3表达可能与宫颈鳞癌发生有关。

研究报道，FXYD3在子宫内膜癌中表达上调是子宫内膜癌进展的早期事件，与年龄、血压、血糖和血脂水平、癌症家族史、绝经年龄、FIGO分期、组织病理学类型、组织学分级、肌层侵犯、宫颈受累度、淋巴结转移和生长方式无关，仅与生育频率呈负相关[10]。本研究基于UALCAN数据库分析FXYD3与宫颈鳞癌患者临床病理参数的关系，结果显示FXYD3在不同肿瘤组织类型中的表达差异有统计学意义，在不同年龄、体重、种族、癌症分期、肿瘤分级、淋巴结转移类型中的表达差异均无统计学意义，与Li等[10]研究结果具有相似性，但在肿瘤组织类型方面有所不同，需继续深入探讨。另有研究报道[11]，FXYD3在宫颈癌组织及细胞系中的表达上调，且与LINC01503通过竞争性结合miR-342-3p正向调控FXYD3的表达机制有关，抑制FXYD3表达可抑制宫颈癌Hela、CaSki细胞增殖、侵袭及迁移。本研究通过收集临床资料分析发现，FXYD3阳性表达与年龄、肿瘤分级无关，而与组织类型、临床分期、淋巴结转移有关，与Peng等[11]研究结果类似，提示FXYD3阳性表达可能与宫颈鳞癌发生及病情程度有关。笔者进一步行生存分析结果表明，FXYD3阳性表达患者具有更短的生存时间，提示FXYD3阳性表达可能是宫颈鳞癌预后的潜在预测生物学标志物。

肿瘤的发生、发展是一个多基因、多因素参与的复杂过程，其中包括抑癌基因失活、促癌基因激活、微环境的改变等多因素相互作用。已有研究显示，FXYD3不仅在正常人体组织中广泛表达，而且在多种肿瘤组织中表达上调，近年来FXYD3作为一种潜在的新型癌症生物学标志物备受关注[12-13]。本研究采用cBioPortal数据库共预测到与FXYD3共表达的基因417个。通路富集分析显示，FXYD3共表达基因主要参与的通路包括癌症相关通路(非小细胞肺癌、膀胱癌及其他癌症)，免疫、炎症调节相关通路(T细胞、B细胞、白细胞介素-17)及各种营养代谢通路(蛋白质水解、核黄素代谢、核酸合成代谢等)，机体免疫状态、营养水平均可影响疾病易感性[14]，提示FXYD3可能与癌症进展密切相关，但关于其在宫颈鳞癌中的表达及作用机制研究尚处于初级阶段，还需深入探究。

综上所述，FXYD3在宫颈鳞癌组织中的表达水平显著升高，且与宫颈鳞癌组织类型、临床分期、淋巴结转移及预后有关，可能成为监测宫颈鳞癌进展的有价值基因。然而，本研究仅分析了FXYD3在宫颈鳞癌组织中的表达及其与患者临床病理参数和预后的关系，纳入的宫颈鳞癌组织及正常组织样本量较少，结果可能存在一定的局限性，是本研究不足之处。下一步我们将通过扩大样本量，探讨FXYD3在宫颈鳞癌中的临床意义，并根据FXYD3共表达基因相关通路进行相关的基础实验，探讨FXYD3在宫颈鳞癌发生、发展中的可能通路机制。