血清5项肿瘤标志物检测对肝癌的临床应用价值

连丽丽,郭睿,张天骄,裴宇梅

(吉林大学第一医院a.检验科，b.耳鼻咽喉头颈外科,长春 130021)

原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)，简称肝癌，是肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤，其发病隐匿、进展快、发病率和死亡率均非常高。早期诊断是降低死亡率的关键，有利于延长患者生存期，提高治疗效果。

血清学标志物在肝癌辅助诊断、预后判断以及高危人群筛查中获得了普遍认可。然而，同时检测血清甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)、甲胎蛋白异质体比率(AFP-L3%)、异常凝血酶原(DCP)和高尔基体蛋白73(GP73)的报道少见，大样本量分析亦仅见个案报道[1-4]。本研究回顾性分析了6 202例慢性肝病及肝硬化和肝癌患者上述5项指标变化，比较单项及联合检测诊断肝癌的Logistic回归、ROC曲线以及阳性率和方法学评价指标。旨在对肝癌的辅助诊断和疗效评价提供实验依据。

1 研究对象与方法

1.1研究对象 选取2019年10月至2020年12月于吉林大学第一医院住院及门诊检测血清AFP、AFP-L3、AFP-L3、DCP及GP73的6 202例患者作为研究对象。其中男4 480例，女1 722例，年龄(54.78±10.94)岁，所有病例经病理学或临床诊断确诊，排除合并其他恶性肿瘤、服用维生素K或者华法林以及血液系统疾患。肝炎、肝硬化、肝癌诊断标准符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[5]、《丙型肝炎防治指南(2019年版)》[6]和《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》[7]。根据肝癌患者经过手术和/或放疗、化疗后是否出现复发或转移(经病理组织学、影像学检查出现伴有远处转移、血管侵犯及单纯肝内肿瘤复发，其中血管侵犯指出现门静脉癌栓或肝静脉癌栓)分为治疗后缓解组和治疗后未缓解组。6 202例患者进一步分为3组：(1)慢性肝病及肝硬化组2 073例，其中男1 248例，女825例，年龄(50.27±10.42)岁，临床诊断包括慢性乙型病毒性肝炎824例、乙肝肝硬化799例、肝血管瘤127例、脂肪肝104例、慢性丙型病毒性肝炎86例、肝囊肿68例、丙肝肝硬化29例、慢性乙型病毒性肝炎合并丙型病毒性肝炎13例、肝内胆管结石9例、自身免疫性肝病5例、肝脓肿5例和肝寄生虫感染4例；(2)肝癌治疗前及治疗后未缓解组2 274例，其中男1 817例，女457例，年龄(57.09±10.20)岁，临床诊断包括乙肝相关肝癌1 610例、丙肝相关肝癌276例、酒精性肝癌175 例、基础肝病原因不明肝癌81例、肝移植状态79例；慢性乙型肝炎病毒合并丙型肝炎病毒感染相关肝癌6例，肝内胆管癌21例，肝细胞癌-肝内胆管癌混合型10例和脂肪性肝癌16例；(3)肝癌治疗后缓解组1 855例，其中男1 415例，女440例，年龄(56.80±10.24)岁，临床诊断包括乙肝相关肝癌1 379例、丙肝相关肝癌238例、肝移植状态133例、肝内胆管癌48例、脂肪性肝癌18例、基础肝病原因不明肝癌14例、肝细胞癌-肝内胆管癌混合型17例和酒精性肝癌8例。3组性别比较使用卡方检验分析(χ2=231.449，P=0.000)，男性比率明显高于女性；3组年龄比较使用单因素方差分析(F=273.149，P=0.000)，慢性肝病及肝硬化组年龄明显低于肝癌组；肝癌治疗前及治疗后未缓解组、肝癌治疗后缓解组年龄比较使用SNK-q检验(P=0.379)，差异无统计学意义。本研究仅收集和分析数据，并不涉及患者的个人信息，经吉林大学第一医院医学伦理委员会审核批准。

1.2方法

1.2.1标本采集与处理 按照本科室样品采集手册要求，使用分离胶促凝管采集静息状态下受试者静脉血3 mL，3 500 r/min 离心10 min，分离血清(不含溶血，脂血标本)待测。标本于4 h内及时检测，分离血清后置于2～8 ℃保存不超过12 h。

1.2.2检测系统及参考区间 采用磁微粒化学发光免疫分析法，按照C2000全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂(北京热景公司)说明书操作。参考区间：AFP 0～7 ng/mL，AFP-L3 0～1 ng/mL，AFP-L3% <10%，DCP 0～40 ng/mL，GP73 0～150 ng/mL。

1.3统计学分析 采用SPSS 17.0及MedCalc软件处理，计量资料不符合正态分布，以中位数(四分位数)[M(P25,P75)]表示，2组间比较采用两独立样本的Wilcoxon(Mann-Whitney)秩和检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。绘制并评估单项及联合检测诊断肝癌治疗前及治疗后未缓解组的ROC曲线；构建Logistic回归预测模型。Delong检验分析ROC曲线诊断效能；Waldχ2检验用于判断自变量与应变量的关联程度。分析5项指标单项及联合检测阳性率以及诊断肝癌的方法学评价指标。

2 结果

2.1各组血清5项指标水平比较 肝癌治疗前及治疗后未缓解组、肝癌治疗后缓解组该5项血清指标与慢性肝病及肝硬化组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。慢性肝病及肝硬化组、肝癌治疗后缓解组男、女AFP水平比较差异有统计学意义(P均<0.05)；肝癌治疗前及治疗后未缓解组、肝癌治疗后缓解组男、女DCP水平比较差异亦有统计学意义(P均<0.05)，且均为男性高于女性。见表1。

表1 血清5项指标检测水平的比较[M(P25,P75)]

2.25项指标单项及联合检测诊断肝癌治疗前及治疗后未缓解组的诊断效能 以慢性肝病及肝硬化组为对照组，肝癌治疗前及治疗后未缓解组为疾病组，绘制ROC曲线。应用Binary Logistic回归，以疾病状态为应变量，检验项目为自变量，构建Logistic回归预测模型，计算新变量(即联合检测的预测概率)，用预测概率制作ROC曲线。Delong检验结果表明，单项检测时AFP的AUCROC(0.914)、AFP-L3和AFP-L3%的敏感性(82.94%)及AFP-L3%的特异性(98.22%)和约登指数(0.812)均高于其他指标。联合检测时AFP-L3%+DCP+GP73及5项联合的AUCROC(0.996)和约登指数(0.955)、AFP-L3%+DCP和AFP+AFP-L3%+DCP的敏感性(97.67%)及AFP+AFP-L3%的特异性(98.12%)均高于其他指标。见图1、表2。

表2 5项指标单项及联合检测的ROC曲线诊断效能分析(n=4 347)

注：A,5项指标单项检测诊断肝癌治疗前及治疗后未缓解组ROC曲线；B,5项指标联合检测诊断肝癌治疗前及治疗后未缓解组ROC曲线。

2.3各指标联合检测与肝癌治疗前及治疗后未缓解组的关联程度 通过Logistic回归，可以量化各指标对疾病的贡献。Waldχ2检验结果表明，AFP、AFP-L3、AFP-L3%、DCP和GP73在不同组合中的回归系数可反映其对肝癌贡献大小。OR值反映其与肝癌关联程度。通过Logistic预测模型，可计算每个样本联合检测的预测概率。与临界值比较，用于判断在一定预测正确率下是否患有肝癌。见表3、表4。

表3 各指标联合检测的Logistic回归模型(n=4 347)

表4 各指标联合检测诊断肝癌治疗前及治疗后未缓解组的Logistic 回归分析(n=4 347)

2.45项指标单项及联合检测阳性率和诊断肝癌的方法学评价 慢性肝病及肝硬化组、肝癌治疗前及治疗后未缓解组AFP阳性率(6.37%、79.77%)和肝癌治疗后缓解组DCP阳性率(17.63%)均高于其他单项指标；3组5项联合阳性率分别为11.82%、99.82%和32.94%，均高于其他联合指标。以疾病诊断为列变量，检验项目为行变量，制作交叉频数表，根据四格表资料，得出诊断试验的方法学评价指标。5项联合的敏感性(69.77%)、总正确率(75.93%)和阴性预测值(59.43%)以及AFP-L3%的特异性(99.37%)和阳性预测值(99.33%)均高于其他指标。见表5、表6。

表5 5项指标单项及联合检测阳性率(n=6 202)

表6 5项指标单项及联合检测诊断肝癌的方法学评价(n=6 202,%)

3 讨论

血清学检验能够比影像学提前3～28个月预警肝癌发生，具有时间短，操作简单，可行性好，准确性高的特点。国际主流的血清学标志物包括 AFP、AFP-L3、DCP等，主要用于肝癌病情动态监测及疗效评价。高危人群(慢性乙型、丙型肝炎和非病毒性肝硬化)和极高危人群(乙型或丙型肝硬化)分别应间隔6个月和3至4个月进行血清学检测[8]。

本研究显示，肝癌治疗前后5项指标均高于慢性肝病及肝硬化者(P<0.05)；慢性肝病及肝硬化组和肝癌治疗后缓解组男性AFP水平高于女性(P<0.05)，肝癌患者男性DCP水平高于女性(P<0.05)，这与多项研究结果一致[9-12]。另有学者报道，DCP与AFP之间无相关性，二者水平变化互不依赖，同时检测有互补效果。故而，本研究进一步分析各指标数据相关性以及各检测指标在不同年龄之间的分布规律。

本研究结果表明，当单项指标诊断肝癌治疗前及治疗后未缓解组时，AFP的AUCROC最高(0.914)，GP73的AUCROC最低(0.800)；AFP-L3和AFP-L3%敏感性最高(82.94%)，DCP敏感性最低(69.04%)，AFP-L3%特异性最高(98.22%)，GP73特异性最低(78.34%)，AFP-L3%约登指数最高(0.812)，GP73约登指数最低(0.476)。AFP-L3%+DCP+GP73和5项联合的AUCROC(0.996)和约登指数(0.955)最高。联合检测时敏感性83.20%～97.67%，特异性94.89%～98.12%，均高于单项指标。AUCROC越大，代表准确性越高。AUCROC为<0.7 表示有较低的准确性，0.7～0.9为有一定的准确性，>0.9为有较高的准确性。约登指数反映该诊断技术发现患者和非患者的总的能力，即诊断性能。临界值即约登指数(即敏感性+特异性-1)最大时对应的实验结果或预测概率值。可见单项检测AFP准确性最高，AFP-L3%诊断效能最高；AFP-L3%+DCP+GP73和5项联合检测的准确性和诊断效能最高，联合检测优于单项检测。

杨璇等[13]报道采用微流控免疫荧光法检测AFP-L3% 诊断原发性肝癌(PHC)的敏感性为66.3%。Sato等[14]报道HCC预测模型最高预测准确性为87.34%(AUCROC:0.940)，当临界值分别为AFP 200 ng/mL、DCP 40 ng/mL和 AFP-L3 15% 时，准确性分别为70.67%(AUCROC：0.766)、74.91%(AUCROC：0.644)和71.05%(AUCROC：0.683)。Shaker等[15]报道GP73和AFP的敏感性、特异性和临界值分别为96.9%、96.9%、17.5 ng/mL和75%、92%、9.4 ng/mL。周静娣等[16]报道AFP-L3%诊断肝癌的临界值为6.10%，特异性76.63%，敏感性61.29%。本研究得出的诊断效能结果与上述研究不尽相同，分析原因，推测可能与入组研究对象的选取、检测系统与方法学不同、样本量大小以及前瞻性和回顾性研究实验数据的差异有关。

通过Logistic预测模型，计算出每个样本联合检测的预测概率，可以量化各指标对于疾病诊断的贡献性，对结果的判定更加客观，可用于疾病的个体诊断。有学者报道，基于性别、年龄、AFP-L3、AFP和DCP构建的GALAD评分系统可提高早期PHC检出率，当GALAD评分的临界值为-0.33 时，诊断敏感性、特异性和准确性分别为91.9%、86.8%和90.7%，AUCROC可达0.960[17]。本研究随机抽取1例不在本次实验统计范围内的患者，其数据为AFP 19.46 ng/mL、AFP-L3 5.11 ng/mL、AFP-L3% 26.25%、DCP 44.92 ng/mL、GP73 139.3 ng/mL，代入Logistic回归方程，得出Logistic(P)=1.000，大于临界值的0.362，说明在预测正确率97.56%的条件下，可判断患有肝癌。

通过Logistic回归可分析各指标与肝癌的相关程度。回归系数(B)表示自变量对因变量贡献大小，B>0时，表明该变量每增加1个单位，比值比(OR)在原来基础上扩大B倍。将B进行指数变换后得到OR值[OR=exp(B)，B=log(OR)]。OR值是反映疾病与暴露之间关联强度的指标，表示影响因素对事件发生的影响方向和能力大小。该因素取值越大，事件发生概率越大。OR=1，该因素对疾病的发生不起作用；OR>1，该因素是危险因素；OR<1，该因素是保护因素。可见AFP-L3%与肝癌的关联强度最高(OR=2.780)，而AFP-L3%+DCP+GP73及5项联合检测的疾病预测正确率最高(97.56%)。

本研究基于所有肝病及肝癌患者数据得出检测阳性率和诊断肝癌的方法学评价指标。AFP作为最常用的肝病项目，其在慢性肝病及肝硬化组、肝癌治疗前及治疗后未缓解组、肝癌治疗后缓解组的阳性率分别为6.37%、79.77%和12.67%，低于多数组合项目，而3组5项联合检测的阳性率分别提高至11.82%、99.82%和32.94%。表明多种标志物联合检测能提高检出率，为肝癌的辅助诊断提供依据。5项联合检测的敏感性(69.77%)和总正确率(75.93%)最高；而 AFP-L3% 特异性最高(99.37%)，但GP73的敏感性和总正确率最低(22.62%和47.44%)，这与多数文献报道的结论一致[12-13，18]。

本研究的局限性主要为由于样本量巨大，未进行临床样本的5项指标数据与肿瘤直径、肿瘤数目、TNM 分期、淋巴结转移、远端转移、分化程度及并发症关系的研究，今后进一步研究方向是分析各指标与肝癌患者临床病理参数的关系。综上所述，肝病和肝癌治疗前后患者血清5项指标发生不同程度改变，联合检测运用Logistic和ROC曲线综合分析，可弥补单项不足，筛选和优化组合对肝癌辅助诊断和疗效评价具有重要的临床应用价值。