血浆细胞外囊泡分离方法的研究进展

廖昕萌，潘炜伦，冯俊杰，李博

(南方医科大学南方医院检验医学科，广州 510515)

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是活细胞分泌到细胞外的膜性囊泡，依据粒径和来源可将其分为：外泌体、微囊泡和凋亡小体[1]。EVs内含有多种生物分子，可参与细胞间信息交流，并反映疾病状况以辅助临床诊断和治疗[2]。EVs广泛分布于血浆、尿液、脑脊液等各类体液[3]，其中血浆标本因具有采集、处理和保存的方法成熟、取材方便、EVs含量丰富(108～1013颗粒/mL)[3]、不同生理和病理条件下EVs数量及其内容物含量差异大等特点，故而血浆EVs在疾病的早期诊断、疗效监测和预后判断中具有极大优势，成为了近年来研究的热点。但血浆EVs的传统分离方法受到多种血浆成分的干扰，难以实现EVs的高效分离，因此，近年来发展了许多新型分离方法以应对传统血浆EVs分离遇到的难题。本文将分析传统血浆EVs分离和鉴定方法，并重点从新型亲和法、微流控法和联合应用法3个方面介绍新型分离方法的研究进展，以期为血浆EVs分离方法的发展提供参考和借鉴。

1 传统的血浆EVs分离和鉴定方法

传统的血浆EVs分离方法包括超速离心法(ultracentrifuge, UC)、超滤法(ultrafiltration, UF)、沉淀法(precipitation)、色谱法(size exclusion chromatography, SEC)和免疫亲和法(immunoaffinity)等(表1)。由于受到血浆中多种复杂成分的干扰，使用传统方法分离血浆EVs存在分离效率低、纯度低、特异性低、EVs受损变性或生物活性低等缺陷，因此，分离后常需使用多种鉴定方法从不同维度验证分离产物(表2)。

表1 常用的传统血浆EVs分离方法

表2 常用的血浆EVs鉴定方法

2 新型血浆EVs分离方法

如今许多新型血浆EVs分离方法能克服传统分离方法的缺陷，实现血浆EVs快速分离，并提高产率、纯度和特异性，满足多种应用的需求。常见的新型血浆EVs分离方法包括：(1)新型亲和法；(2)微流控法；(3)联合应用法。

2.1新型亲和法 亲和法因高度特异性而被广泛用于血浆EVs的分离，利于不同疾病的深入研究(表3)。除了免疫亲和法外，脂质亲和法和二氧化钛(TiO2)亲和法也是近年来血浆EVs分离的新策略。此外，亲和法中的配体也可以是适配体、多肽类、跨膜蛋白和肝素。

表3 新型亲和法在血浆EVs分离中的应用

然而，所有亲和法都存在一定局限性：(1)截至目前，没有研究发现存在于所有EVs的通用型表面标志物，因此，表面标志物的数量和表达量会影响分离产率，使得产率小于实际样本中的EVs数量，导致EVs所含的重要信息在后续检测中被遗漏；(2)许多疾病的特异性表面生物学标志物依旧未知，故而无法通过亲和法进行相关疾病的EVs分离[24]；(3)特异性结合物会破坏EVs的生物活性和功能，影响其下游实验的检测和应用；(4)血浆中的杂质蛋白会与配体、反应板或EVs表面多个竞争性结合位点发生非特异性结合，导致EVs的捕获率、释放率和分离纯度降低；(5)试剂和材料成本较高，难以在临床应用中推广和普及。

2.2微流控法 近年来血浆EVs分离方法发展的主流趋势是建立微流控分离平台。这种分离方法通过结合声学、电泳或电磁场等先进技术，根据EVs的物理和生化特性实现高通量的非接触式分离(表4)。该方法无需特殊的生物学标志物，产率较高，能保护EVs的结构、内容物和功能不受破坏，实现分级分离，是血浆EVs分析实验前处理的理想方法。同时，微流控分离法能将血浆EVs的分离、表征和检测同时结合在单个装置上，实现其研究的集成化和一体化。虽然目前微流控分离法仍缺乏成熟的行业标准和规范，且分离效果易受实验试剂和外界环境的影响[25]，但其体积小、分离样本量下限低、自动化程度高等特点使它仍具有广阔的临床应用前景。

表4 非接触式微流控平台在血浆EVs分离中的应用

2.3联合应用方法 血浆EVs的分离方法各有优缺点，适用于不同的标本类型，为了弥补单一方法的局限性，目前许多研究联合使用多种分离方法以达到更优的分离效果(表5)。通常情况下，UC、UF作为血浆EVs分离策略的前几步骤，用于去除血浆中的死细胞、细胞碎片等大颗粒杂质，而SEC、沉淀法等则用于后续EVs的纯化分离，如Koh等[32]先用UC滤除血浆中大分子物质，再用SEC滤除可溶性蛋白质，该联合方法的产率、杂质蛋白清除率均明显高于单独使用UC或SEC。近年来，许多研究也将新旧分离方法相结合，不仅能延续传统方法的优势，实现更快速、精准的分离，也能让分离平台更加小型化、便携化，利于分离方法在临床应用中的发展。不过，虽然联合应用方法能取长补短，但往往操作步骤繁琐，分离过程中EVs的损失较多，分离产率不理想。

表5 联合应用方法在血浆EVs分离中的应用

3 血浆EVs分离面临的挑战

截至目前，仍然没有一种分离方法能适用于所有血浆EVs的研究目的，也无法完全去除血浆中干扰物质对EVs分离的影响，分离血浆EVs仍存在许多困难和挑战。血浆EVs分离过程中常见的干扰物质有血浆蛋白、脂蛋白、游离核酸等生物有机大分子，而一些细胞、细胞碎片和病毒颗粒[39]因形态和体积与EVs相似，也会影响UC、UF和SEC等物理分离方法。此外，血浆的粘度、密度和离子强度等环境因素会影响部分微流控分离法。这些干扰因素都使得在分离血浆EVs时需要更谨慎地选择分离方法。

由于下游研究目的不同，导致实验对EVs纯度、来源和产量等要求不同，故而样本类型、采集和前处理方法对于分离临床样本中的血浆EVs也至关重要。血液中多数的EVs由血小板释放产生，血液凝固、采血针孔过小和反复冻融操作等都极易诱发血小板释放EVs[40]。因此，如果需要研究血小板EVs或下游实验需要大量囊泡结构，则选用血清样本进行EVs分离会更高效；而如果要检测特定类型的疾病特异性EVs亚群，则推荐选用血浆样本，以最大程度去除血小板EVs，并避免血小板持续产生EVs而导致后续分析出现错误结果[41]，还原样本中最接近实际情况的EVs浓度和比例。此外，临床标本采集中使用的抗凝剂也会影响血浆EVs的分离和鉴定，如肝素能与EVs结合、促进血小板活化及抑制PCR反应[42]。虽然国际血栓和止血协会(International Society on Thrombosis and Haemostasis)推荐选用柠檬酸盐作为血浆EVs研究时的抗凝剂[43]，但其抑制血小板活化的效果弱于乙二胺四乙酸(EDTA)和ACD抗凝剂[44]。因此，应具体根据下游分析和实验目的选择合适的抗凝剂。

4 总结与展望

血浆EVs 在疾病检测、诊断、治疗、预后和药物传递中的应用潜力已被许多研究证实[45]。传统EVs分离方法已经不再能满足研究的需求，人们对EVs研究兴趣的增长又促使许多先进新型分离方法的诞生。由于各类方法具有不同的分离原理和步骤，为了能更高质量地获得所需的EVs，联合应用方法已成为许多研究的共同趋势。而根据实验目的选择合适的分离方法，可以大大减少血浆EVs分离过程中的主要干扰因素，更有效地接驳后续分析研究和下游应用，例如：(1)UC、UF和微流控法的产率较高，适用于血浆EVs需求量大的研究；(2)免疫亲和法的产物纯度和特异性高，适用于血浆中特定EVs表面标志物的研究；(3)SEC、微流控法和免疫亲和法的血浆蛋白和脂蛋白清除率高，适用于筛选血浆EVs蛋白标志物；(4)微流控法的产物结构相对完整、粒径均一[27]，且产物核酸含量能满足后续检测的需求[9]，适用于血浆EVs的表征等受物质形态影响较大的研究，也适用于疾病的基因分析，利于疾病早期筛查。而随着现代生物技术不断进步，血浆EVs分离方法在未来也会持续推陈出新，大力推动EVs研究和“液体活检”的发展。