桃PpNCED家族成员鉴定与表达特性分析

张泽华，万淑媛，李 琴，刘福云，赵彩平

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨凌 712100)

桃[Prunuspersica(L.)Batsch.]果实不耐贮藏，货架期短，是制约桃产业发展的主要问题之一。因此，研究桃果实的成熟软化调控机制对延长贮藏期十分重要。

植物激素ABA对果实的成熟软化具有重要的调控作用。研究表明，ABA可以通过调控乙烯、细胞壁、生长素和糖酸代谢相关基因来调控果实的成熟软化[1-2]。Zhang等[3]对桃和葡萄的研究显示，ABA主要在果实的成熟启动阶段起重要调控作用，但Jacqueline等[4]在鳄梨中的研究表明，ABA的高峰出现在乙烯高峰之后。

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)是ABA合成途径中的限速酶，对于ABA的合成至关重要[5-7]。NCED家族成员已在多个物种上被鉴定出来，且在进化上较为保守[3,5,7-10]。值得注意的是，NCED家族成员中不是每个都与ABA合成相关。比如，拟南芥上鉴定出的9个NCED成员，只有5个与ABA合成相关[5]。在鳄梨上，NCED2为组成型表达，由于缺乏叶绿体转运肽，所以很可能不参与ABA的合成[4]。

NCED对于果实的成熟具有重要的作用。在番茄上，沉默SlNCED1会延缓果实成熟进程，使果实无法正常着色，质地相关基因被下调[11]。此外，NCED基因表达也会受到外源ABA调节剂的影响。比如，外源ABA处理可以显著提高草莓、樱桃NCED基因的表达水平[12-13]。但有意思的是，在番茄上，外源ABA不会影响内源ABA的积累和NCED的表达水平[3]，说明不是所有的NCED都会响应外源ABA。另外，沉默ABA代谢基因SlCYP707A2会导致SlNCED1表达水平上升，表明ABA在番茄体内可能存在负反馈调节网络[11]。而在黄瓜果实未熟期喷施ABA，对黄瓜果实成熟没有明显的影响，但在转色期喷施则可以使CsNCED1、CsNCED2基因的表达水平升高[14]。说明NCED响应外源ABA可能与果实所处生理阶段有关。近年来，关于桃上NCED的研究有一些报道，但不系统。首先，桃NCED基因是否响应外源ABA，Soto等[1]的研究表明，NCED对外源ABA的响应特性取决于桃果实发育的生理阶段。其次，ABA如何调控桃果实的成熟，Wang等[15]的研究显示，PpERF3可以结合在NCED2/3的启动子上，正向调控NCED2/3的基因表达，说明乙烯与ABA可能协同调控桃果实的成熟。此外，桃上的NCED家族成员的系统鉴定还未见相关报道。NCED成员在不同桃品种之间是否存在不同的表达特性？不同的NCED成员之间对外源ABA的响应是否一致？这些问题都还未解决。

因此，本研究鉴定桃中的NCED家族成员，并分析其在不同器官、果实不同发育阶段以及在不同耐贮性桃果实中的表达特性，以期明确与桃果实成熟可能相关的NCED基因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以桃栽培品种‘浅间白桃’(QJBT)，‘秦王’(QW)和‘美秋’(QM)为试材，种植于西北农林科技大学桃种质资源圃。

不同组织样品的采集：以‘浅间白桃’品种为试材，采集根(须根，直径2 mm左右)、茎(新梢)、叶(1 a生新梢上第2～4片成熟叶)、花(未完全展开的花)、果实(幼果)。

果实发育期样品的采集：以‘秦王’桃品种为试材，采集花后65 d、95 d和110 d的桃果实。

不同耐贮性果实样品的采集：采摘处于商品成熟期的不耐贮藏的‘浅间白桃’和极耐贮藏的‘秦王’桃果实。‘浅间白桃’果实在采收当天及贮藏过程中每隔2 d取样，‘秦王’每隔4 d取样。

1.2 试验处理

ABA处理及样品采集：以‘美秋’为试材，在果实采收前一周，选择树型、长势、树龄一致的3棵桃树，在每棵树的2个主枝上，分别用50 μmol/L的ABA和清水喷施，每隔3 d喷施1次，共喷施2次。在商品成熟期采收果实，在采收当天及贮藏过程中每隔2 d取样。

1.3 试验方法

1.3.1 桃NCED基因家族成员鉴定与生物信息学分析 在拟南芥基因组数据库(TAIR)下载所有的拟南芥NCED基因，以拟南芥AtNCED的基因序列在NCBI tblastn用于搜索桃基因组数据库，桃基因的完整氨基酸序列从蔷薇科基因组数据库(GDR)中获得。所有检索出的基因(E-value≤ 0.005)都利用DNAMAN软件进行多重序列比对并使用保守结构域进行分析，删除不含保守结构域的基因。使用SignalP 4.1Server分析信号肽。利用在线程序ExPASy ProtParam对PpNCED基因编码蛋白的等电点和分子量进行分析。使用MapDraw软件将基因定位到染色体，根据其在染色体上的位置对其进行命名。系统进化树用MEGA 6.0软件进行构建，采用邻接法(NJ)，重复1 000次。

1.3.2 RNA提取和实时定量荧光PCR(qRT-PCR)分析 采用CTAB法提取RNA，通过凝胶电泳检测总RNA的完整性，用紫外分光光度计来检测OD260、OD280值，从而判断RNA的纯度和浓度。

表1 桃NCED基因家族定量引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR analysis of peach NCED genes family

1.4 数据处理

用Excel 2010和Spss 22对试验数据进行处理和统计分析，用Excel 2010绘图。

2 结果与分析

2.1 桃NCED基因家族成员的鉴定和生物信息学分析

2.1.1 桃NCED基因家族成员的鉴定 共鉴定出7个桃NCED基因家族成员：prupe.1G061300.1，prupe.1G255500.1，prupe.1G255500.2，prupe.2G014700.1，prupe.2G014700.2，prupe.4G082000.1，prupe.4G150100.1。所有成员均含有高度保守的视网膜色素上皮膜蛋白结构域RPE65(图1-a)。根据其染色体定位，分别命名为PpNCED1、PpNCED2a、PpNCED2b、PpNCED3a、PpNCED3b、PpNCED4和PpNCED5。NCED基因家族成员分布在3条桃染色体上，一号染色体上有3个PpNCED基因，二号和四号染色体上各有2个PpNCED基因(图1-b)。7个NCED家族成员均无信号肽，PpNCED1～PpNCED5编码的氨基酸长度为427～632 aa，预测蛋白的等电点为5.64～7.24，分子质量为47.30～70.35 ku (表2)。

表2 NCED蛋白理化特性Table 2 Physical and chemical properties of NCED protein

2.1.2 基因系统进化树分析 将桃、苹果、葡萄、柑橘、樱桃、梅、拟南芥上已报道的NCED基因构建系统进化树。结果表明，PpNCED1与梅PmNCED6同源性最高；而PpNCED2a、PpNCED2b与拟南芥的AtNCED4高度同源，PpNCED3a、PpNCED3b与拟南芥的AtNCED1同源性较高；PpNCED4与樱桃PacNCED5基因同源性最高；PpNCED5与梅PmNCED1高度同源。此外，根据拟南芥上NCED基因家族成员的分类，将桃上的NCED基因分为两个亚家族。其中，PpNCED1、PpNCED4、PpNCED5属于亚家族Ⅰ；PpNCED2a、PpNCED 2b、PpNCED3a、PpNCED3b属于亚家族Ⅱ(图1-c)。

2.2 桃NCED基因家族成员组织特异性分析

如图2所示，5个基因在不同的组织部位表达情况各不相同。其中，PpNCED1只在茎、叶中有表达。PpNCED2、PpNCED3均表现出在花中的表达量较高，在叶和茎中有少量表达，在根和幼果中表达量较低。PpNCED4在茎和花中表达量较高，在幼果中次之，在叶中表达量较低。PpNCED5在茎中大量表达，其次为根、花、幼果，在叶片中表达量较低。

2.3 果实发育期间NCED基因家族成员表达特性分析

为了研究NCED基因家族成员在桃果实发育阶段中可能的作用，选取‘秦王’品种，分析花后65 d至果实成熟期NCED成员相对表达量的差异。图3结果显示，在花后65 d，果实中几乎检测不到PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5的表达丰度，而其后随着果实的膨大和成熟，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5均呈上调表达趋势，且在果实成熟期达到表达高峰。

2.4 不同耐贮性桃果实成熟软化期间NCED基因家族成员表达特性分析

为了研究NCED基因家族成员在桃果实成熟软化中可能的作用，本研究分析‘浅间白桃’‘秦王’和‘美秋’果实采后贮藏期间NCED成员相对表达量的差异。图4结果显示，在不耐贮桃‘浅间白桃’和耐贮藏的‘秦王’果实的采后贮藏期间，PpNCED2的相对表达量均呈缓慢下降趋势，且在采收当天表达量最高。而PpNCED3在‘浅间白桃’中的相对表达量从采后0～2 d先下降，第2天开始逐渐上升，在第6天达到表达高峰。PpNCED4、PpNCED5在‘浅间白桃’果实贮藏期间几乎检测不到表达量(图4)。

PpNCED3、PpNCED4在‘秦王’果实贮藏期间的表达模式相似，均为双峰曲线。PpNCED3的第一个表达高峰在采后第12天，第二个表达高峰在采后第24天。PpNCED4在采后第4天达到第一个表达高峰，此后迅速下降，在采后第20天达到第二个表达高峰。而PpNCED5在‘秦王’果实采收当天表达量最高，之后逐渐下降，到采后第20天后呈缓慢上升趋势(图4)。

在‘美秋’果实采后贮藏期间，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5整体均呈上调表达趋势，PpNCED2、PpNCED3的表达量在贮藏的前2 d迅速升高，后呈下降趋势，PpNCED3在贮藏末期表达量又升高。PpNCED4、PpNCED5表达量的变化趋势较一致，均在采后的0～4 d表达量逐渐上升，在第4天后又均呈下降趋势(图5)。

试验结果还表明，在不同桃品种果实中，NCED家族成员的表达丰度存在差异。PpNCED2在‘秦王’和‘美秋’果实贮藏期间的整体表达量显著高于‘浅间白桃’；而PpNCED3在‘秦王’果实中的整体表达量低于‘浅间白桃’和‘美秋’。

2.5 外源ABA处理后桃成熟软化期间生理指标变化及NCED基因家族成员的响应特性

为了进一步探究NCED基因家族成员在桃果实成熟软化期间对外源ABA的响应特性，对‘美秋’桃进行外源ABA处理。结果显示，外源ABA处理后，贮藏期间桃果实硬度始终低于对照果实，且在采后0 d和2 d差异显著。此外，ABA处理和对照果实均表现出从贮藏0～4 d乙烯释放量缓慢升高，4 d～6 d迅速升高并出现峰值，且外源ABA处理果实的乙烯释放高峰显著高于对照。外源ABA处理后，在采收当天，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5的表达均被显著促进；在贮藏第2天，PpNCED4、PpNCED5的表达量也显著高于对照果实；而PpNCED2、PpNCED3在贮藏第2～4天的表达量被显著抑制(图5)。总的来说，在贮藏前期，NCED家族成员表达量呈现出被外源ABA上调的趋势，而中后期整体呈现下调的趋势。

3 讨 论

桃果实深受消费者的喜爱，但其容易软化腐烂是制约商品价值的重要原因。因此，关于桃果实成熟软化的调控始终是一个研究热点。ABA可以促进果实的成熟软化，而NCED作为ABA合成途径中的限速酶，在该调控途径中尤为关键[5-7]。许多物种中已经鉴定出了NCED基因家族成员，且各物种中的家族成员数目不同，这可能与染色体加倍有关[5,16-17]。在本研究中，共鉴定出7个NCED基因，并发现它们都在NCED的第一和第二亚家族内。在桃中关于NCED的研究报道大都聚焦于NCED第一亚家族的成员[1,15,18]，即本研究中鉴定出的PpNCED1、PpNCED4、PpNCED5。第二亚家族的成员相关报道较少。

系统进化树结果表明，PpNCED1与葡萄VvNCED6和拟南芥的AtNCED6的同源性较高。VvNCED6可能参与调控葡萄的花色苷的积累[19]；而AtNCED6与拟南芥种子休眠相关[20]。在本研究中，PpNCED1在果实中几乎不表达(图2)，说明PpNCED1可能不参与桃果实的成熟调控。PpNCED4与草莓FaNCED1同源性较高，FaNCED1在调控草莓果实成熟中发挥重要作用，沉默FaNCED1导致草莓内源ABA水平降低及果实的不着色表型[21]。本研究中，PpNCED4在‘秦王’和‘美秋’成熟软化期间均呈上调表达趋势(图4，图5)，说明其可能与桃果实成熟相关。PpNCED5与樱桃的PacNCED1高度同源，PacNCED1在樱桃果实成熟过程中具有重要作用[13]，由此可以推断桃PpNCED5也可能与桃成熟密切相关。

此外，本研究结果显示，NCED基因家族成员的表达具有明显的组织特异性，这与甜樱桃中的研究结果相似[22]。在果实中表达的NCED基因家族成员数目在不同品种间也存在差异，在不耐贮藏的‘浅间白桃’果实中，只有PpNCED2、PpNCED3表达，而在极耐贮藏的‘秦王’果实和较耐贮藏的‘美秋’果实中，除PpNCED1外，其他NCED成员均有一定表达量(图4，图5)。

不同NCED成员在桃果实发育与成熟软化过程中的表达模式既有相似之处，也存在差异。在果实发育过程中，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5均表现出随果实发育表达量升高，在成熟期达到表达高峰(图3)；在果实贮藏期间，PpNCED2、PpNCED5的表达量均呈下降趋势(图4)。番茄SlNCED1、柿子DkNCED1和甜樱桃PacNCED1的表达量也表现出在果实绿熟期增加，在成熟转变期达到高峰，后熟期迅速下降的趋势[11,13,23]。而PpNCED2、PpNCED5在‘美秋’的成熟期间呈现出先升后降的趋势，表明不同品种间的表达模式存在差异(图5)。在‘秦王’和‘美秋’贮藏期间，PpNCED3、PpNCED4的表达量均表现出较为一致的双峰曲线变化趋势，且伴随着表达量高峰的出现，果实硬度迅速下降，因此，其可能与果实软化相关(图4，图5)。

已有研究表明，ABA对NCED基因表达的调控与果实所处的发育阶段有关。在桃果实膨大期(S3中期)喷施ABA，会抑制NCED基因的表达，而在S3/S4和S4时期，ABA处理后NCED基因表达量被上调[1]。在黄瓜果实未熟期喷施ABA对黄瓜果实成熟没有明显的影响，而在转色期喷施则上调CsNCED1、CsNCED2基因的表达水平，促进黄瓜果实的成熟[14]。本研究结果显示，在果实成熟前1周，外源喷施ABA后，果实硬度显著降低，乙烯释放峰值显著升高，表现出对果实成熟有显著的促进作用。外源ABA处理后，均表现出在贮藏早期显著促进PpNCED家族成员的表达，而在贮藏中后期显著抑制PpNCED家族成员的表达，可能是负反馈调节的结果(图5)。植物体内的激素水平需要保持稳态，比如，乙烯处理番茄可以通过上调SlACS2、SlACS4和下调SlACS6的转录来正向或负向调节乙烯的生物合成[24]。果实内ABA的生物合成是否也存在这种调节机制还有待进一步研究。