橡胶树胶孢炭疽菌组蛋白乙酰转移酶CgGCN5调控致病力功能研究

刘世科 安邦

摘  要：胶孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡胶减产的主要原因之一。研究该病原菌致病力的分子机制能够为新型防控策略的研发提供理论依据。在橡胶树胶孢炭疽菌中，存在1个编码组蛋白乙酰转移酶的基因CgGCN5。在本研究中，通过同源重组原理及原生质体转化法构建了橡胶树胶孢炭疽菌CgGCN5的敲除突变株和互补菌株，并对其生长、产孢及致病力等表型进行了初步分析。结果表明，与野生型菌株相比，CgGCN5敲除突变株的生长速率、产孢能力均显著下降;并且突变株对橡胶树叶片的致病力也显著下降;进一步分析表明，突变株丧失了对玻璃纸的穿透力。与此同时，互补菌株能够恢复突变株的相应表型。以上结果表明，CgGCN5在调控胶孢炭疽菌的生长及致病力中起重要作用。

关键词：胶孢炭疽菌;组蛋白乙酰转移酶;GCN5;致病性

中图分类号：S763.7      文献标识码：A

Functional Analysis of Histone Acetyl-transferase CgGCN5 in Regulation of Pathogenicity of Colletotrichum gloeosporioides from Hevea brasiliensis

LIU Shike， AN Bang*

College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： The anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides is one of the major reasons for resulting in reduction of rubber yield in Hainan. Figuring out the molecular mechanisms of pathogenicity of C. gloeosporioides could provide basis for controlling strategy against the pathogen. The histone acetyl-transferase encoding gene CgGCN5 was identified in the genome of C. gloeosporioides. In the present study， the CgGCN5 knock-out mutant and the complementation mutant strains were constructed by homologous recombination strategy. Phenotype analysis revealed that the vegetative growth and sporulation were significantly reduced in the knock-out mutant. The pathogenicity of the mutant to rubber leaves was also significantly impaired. Further analysis suggested that the knock-out of CgGCN5 lead to the loss of penetration ability of the pathogen to cellophane. In addition， the impair of growth and virulence were restored in the complementation strain. The results suggested that CgGCN5 plays important roles in the regulation of growth and pathogenicity of C. gloeosporioides.

Keywords： Colletotrichum gloeosporioides; histone acetyl-transferase; GCN5; pathogenicity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.029

天然橡膠主要来源于橡胶树，其合成的天然橡胶被广泛应用于国防和国民经济建设中，具有重要的战略价值和经济意义[1]。在天然橡胶生产中，炭疽病是影响天然橡胶产量和品质的重要制约因素之一，其中胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是造成炭疽病的主要病原菌之一。深入了解胶孢炭疽菌调控致病力的分子机制，能够为新型杀菌剂的研发提供理论依据。

近年来的研究表明，表观遗传在调控生物的生长、发育、逆境响应等多种过程中都起着重要作用[2-3]。组蛋白是真核生物染色体的主要构成部分，而组蛋白的多种修饰方式可引起染色体局部构象发生改变，进而调控真核生物相关基因的表达或沉默。其中，组蛋白的乙酰化修饰是一类重要的组蛋白修饰方式[4-5]。组蛋白乙酰化水平由2类酶决定，包括组蛋白乙酰转移酶（histone acetyl-transferases， HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase， HDAC）。HAT对组蛋白进行乙酰化修饰，使DNA的结构更加松散，因而基因更加容易表达。HDAC则能够将乙酰基从组蛋白H3、H4的N末端赖氨酸残基上移去，使得染色质结构变得相对致密，转录调节因子不易接近DNA，从而抑制某些基因的表达。组蛋白乙酰转移酶GCN5首次在酵母中被鉴定为应激反应基因[6]，其涉及多种细胞功能。在脊椎动物中，GCN5参与组蛋白和非组蛋白的乙酰化、转录调控、细胞周期控制、早期胚胎发育、一定条件下淋巴细胞的活化、代谢性疾病等生理生化过程[7-11]。在植物中，GCN5广泛参与生长发育过程，包括光响应、花器官分生过程、根的生长、铁内稳态、耐热过程、细胞壁完整和盐胁迫等进程[12-16]。在真菌中，GCN5参与调控菌丝生长、胁迫应答、有性和无性生殖、对寄主致病力等生命活动[17-20]。通过蛋白序列比对发现，在橡胶树胶孢炭疽菌基因组中存在1个编码GCN5蛋白的基因，命名为CgGCN5。至今为止，尚无有关橡胶树胶孢炭疽菌CgGCN5功能的研究报道。在本研究中，通过构建CgGCN5基因的敲除突变株和互补菌株，及对突变株的生理表型的分析，初步阐明CgGCN5在胶孢炭疽菌中的功能。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌株及试剂  试验中用到的橡胶树胶孢炭疽菌野生型菌株（WT）、基因敲除载体均为本实验室鉴定及保存，克隆载体pEASY-Blunt及感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2  培养基  马铃薯浸膏培养基（PDA）：购于北京双旋微生物培养基制品厂。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L，琼脂粉15 g/L。

完全培养基（complete medium， CM）：20×Nitrate 50 mL/L，1000×Trace Element 1 mL/L，1000×Vitamin 1 mL/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母提取物1 g/L，酸水解酪蛋白1 g/L。

原生质体再生培养基：酵母提取物1 g/L，酸水解酪蛋白1 g/L，蔗糖342 g/L，琼脂1%～1.2%。

1.2  方法

1.2.1  CgGCN5基因上下游同源臂的克隆  根据试验前期预测的橡胶树胶孢炭疽菌乙酰转移酶CgGCN5的核酸序列，并以试验前期提取的橡胶树胶孢炭疽菌野生型基因组为模板，设计引物CgGCN5-5F/CgGCN5-5R和CgGCN5-3F/CgGCN5- 3R（表1）扩增CgGCN5上游同源臂序列和下游同源臂序列。

1.2.2  敲除及互补载体的构建  本试验采用同源重组原理对目标基因进行敲除，具体策略如图1A所示：对测序结果正确的上下游同源臂分别进行双酶切，并分步连入敲除载体pBS-SUR（含氯嘧磺隆抗性基因SUR），獲得敲除载体pBS-SUR- CgGCN5。以本实验室保存的真菌基因表达载体为骨架（含潮霉素抗性基因HPT），以CgGCN5-F/ CgGCN5-R扩增CgGCN5的CDS序列，并将其连入构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA及色氨酸终止子TtrpC之间，获得互补载体。

1.2.3  胶孢炭疽菌原生质体的制备与转化  参照本实验室建立的原生质体转化方法[21]，将线性化的敲除载体转入胶孢炭疽菌野生型菌株的原生质体，再使用氯嘧磺隆（100 μg/mL）筛选敲除突变株的转化子。以筛选获得的敲除突变株为受体菌株，将线性化的互补载体转入其原生质体，再使用潮霉素（250 μg/mL）筛选互补菌株的转化子。

1.2.4  ?CgGCN5敲除突变株与互补菌株鉴定及分离  对于敲除突变株，提取阳性转化子的基因组DNA进行PCR检测。具体策略如图1所示：通过在上下游同源臂的外侧及抗性基因SUR的序列中设计2对检测引物CgGCN5-JC5F/CgGCN5- JC5R和CgGCN5-JC3F/CgGCN5-JC3R，进行2轮PCR，鉴定转化子中基因敲除片段是否正确重组到目标基因位点。在获得正确的敲除突变株后，进一步通过单孢分离对筛选到的突变株进行分离纯化，并使用CgGCN5的DNA序列的扩增引物CgGCN5-F/CgGCN5-R检测目标基因是否已经完全敲除。最后将获得的纯合体突变株保存备用。

在获得互补菌株之后，提取其基因组，再以CgGCN5-F/CgGCN5-R扩增CgGCN5的CDS序列，检测目标基因是否已经敲入。

1.2.5  ?CgGCN5产孢量分析  选取在PDA培养相同天数的胶孢炭疽菌野生型、敲除突变株及互补菌株，用手术刀在菌落边缘切割1 mm × 1 mm菌块，置于装有30 mL CM液体培养基的锥形瓶中，120 r/min，28 ℃振荡培养3 d后，滤膜过滤除去菌丝，收集孢子，利用显微镜计数。之后将孢子加入30 mL新鲜的CM培养基中，使得孢子初始浓度为1×103 CFU/mL;接着将菌液120 r/min，28 ℃振荡培养，观测孢子产量。

1.2.6  ?CgGCN5致病性分析  选取在PDA培养相同天数的胶孢炭疽菌野生型、敲除突变株及互补菌株，用手术刀在菌落边缘切割1 mm × 1 mm菌块，置于装有30 mL CM液体培养基的锥形瓶中，120 r/min，28 ℃振荡培养3 d后，滤膜过滤除去菌丝，收集孢子，无菌水洗涤2遍，利用显微镜计数，调整孢子浓度为1×107 CFU/mL。再选取淡绿期橡胶树叶片，用针尖刺伤并接种菌液10 μL，28 ℃保湿培养，观测叶片发病情况。

1.2.7  ?CgGCN5侵染能力测定  剪取与培养皿大小一致的玻璃纸，灭菌后将其平铺在PDA平板上。之后在玻璃纸上接种野生型、敲除突变株及互补菌株，在28 ℃培养箱中培养4 d后，揭去玻璃纸继续培养，观测菌株对玻璃纸的穿刺能力。

2  结果与分析

2.1  CgGCN5的生物信息分析

根据生物信息学分析，CgGCN5基因序列包含完整的开放阅读框架数据，DNA序列大小为1347 bp，cDNA序列大小1182 bp，该基因含有2个内含子，编码一条含有393个氨基酸的多肽。进一步利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg. de/）对CgGCN5基因编码的蛋白序列分析，发现CgGCN5蛋白含有一个Acetyltransf_10结构和一个BROMO结构域（图2）。

2.2  ?CgGCN5突变株的获得及鉴定

将敲除载体转入胶孢炭疽菌原生质体后获得了多个阳性转化子。之后，利用PCR扩增检测各转化子。结果如图3A、图3B所示，成功扩增出上游同源臂检测序列（1420 bp）及下游同源臂检测序列（1560 bp）。然后对正确的敲除突变株进行单孢分离，并进一步PCR扩增检测其CgGCN5编码序列，结果如图3C所示，表明突变株中的CgGCN5的编码序列已经完全敲除，成功获得了敲除突变株。将该突变株命名为?CgGCN5，保存备用。以敲除突变株为受体菌株，转入线性化的互补载体，之后利用PCR检测转化子中是否已经转入该基因的编码序列。结果如图3D所示，挑选的3个转化子均转入CgGCN5的CDS序列（1182 bp），表明成果获得了互补菌株，并将互补菌株命名为Res-?CgGCN5。

2.3  ?CgGCN5突变株的生长及产孢能力观测

用打孔器在WT和突变株菌落边缘打取菌饼，把菌饼接到PDA培养基上，在28 ℃培养箱中培养。在生长到第5天时，WT与Res-?CgGCN5的菌落直径均约为7.4 cm，而?CgGCN5菌落直径仅为3.6 cm（图4A，图4B），表明?CgGCN5的营养生长受到显著影响。与此同时，在液体培养基中振荡培养4 d后，WT培养液中的孢子浓度约为2×107 CFU/mL，而?CgGCN5培养液中的孢子浓度仅为7×105 CFU/mL，与此同时，Res- ?CgGCN5的产孢能力与WT相当（图4C），说明CgGCN5的缺失也显著影响突变株的产孢能力。

2.4  ?CgGCN5致病性分析

将野生型和突变株菌液接种淡绿期橡胶树叶片4 d后，WT与Res-?CgGCN5造成的病斑均约为1.5 cm，而?CgGCN5病斑直径约0.5 cm，WT病斑直径约是?CgGCN5病斑直径的3倍，表明?CgGCN5的致病力较WT显著下降（图5）。

2.5  ?CgGCN5对玻璃纸穿透能力测定

将WT和突变株在玻璃纸上培养4 d后揭去玻璃纸，并继续培养1 d。结果发现，WT和Res- ?CgGCN5均能够在玻璃纸下层的培养基上生长，表明它们能够穿透玻璃纸;而?CgGCN5菌株不能在下层培养基生长，表明其已经丧失了对玻璃纸的穿透能力（图6）。

3  讨论

炭疽菌属（Colletotrichum spp.）是典型的半活体寄生（hemibiotrophic）型的植物病原真菌。在其侵染寄主的过程中，基因的表达模式呈现出明显的有序性[22]。表观遗传在调控生物基因的时空表达过程中起着重要作用[2]。本研究对胶孢炭疽菌乙酰基转移酶CgGCN5的调控致病力的功能进行了探索。蛋白结构分析表明，CgGCN5含有一个典型的乙酰基转移酶结构域Acetyltransf_10（Pfam）和一个BROMO结构域;乙酰基转移酶能在辅因子乙酰辅酶A作用下催化乙酰基转移到组蛋白赖氨酸侧链的ε氨基上，中和赖氨酸原有的正电荷，来削减组蛋白与带负电DNA之间的相互作用，更利于组蛋白与DNA分离，为DNA与转录因子的结合创造条件，来促进该处基因的表达[23];具有BROMO结构域的蛋白质能够读取与表观遗传信息传递相关的乙酰赖氨酸标记，以读取者的角色在表观遗传调控中发挥作用，最终决定对蛋白质功能的调节[24]。

为了进一步分析CgGCN5的功能，本研究构建了CgGCN5的敲除突变株?CgGCN5及互补菌株Res-?CgGCN5，并对突变株的生理表型进行了检测。结果发现，?CgGCN5的菌丝生长速率显著低于野生型及互补菌株;在白色念珠菌（Candida albicans）及禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）中也發现了类似的结果[17， 19]。通过无性繁殖产生分生孢子是病原真菌传播、侵染寄主过程中的一个重要步骤。在C. albicans中，GCN5能够通过调控多个分生孢子形成相关因子，如调控brlA等的表达，来调控分生孢子的产生[18]。而在本研究中，CgGCN5的缺失导致胶孢炭疽菌的产孢能力受到极大影响;在液体培养环境中，?CgGCN5的产孢量比野生型菌株及互补菌株降低了约30倍。胶孢炭疽菌主要通过2种方式侵染橡胶树叶片：一是通过伤口进入叶片;二是通过形成附着胞穿透并侵染幼嫩叶片。在本研究中发现，?CgGCN5在叶片伤口处形成的病斑大小仅约为野生型菌株及互补菌株的三分之一;与此同时，?CgGCN5也丧失了对玻璃纸的穿透能力。这2个结果表明?CgGCN5的致病力受到明显影响。

综上，CgGCN5调节的表观遗传修饰在调控橡胶树胶孢炭疽菌菌丝生长、产孢、致病力过程中起着重要的调控作用;同时表明CgGCN5调控了多个下游靶标，但其在胶孢炭疽菌中的作用机制仍不明确，有待进一步的试验研究。

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责任编辑：谢龙莲