基于磁珠捕获和连接的免核酸提取的恒温扩增技术

邱栎臻，杨明珠，骈红茹，郑 直

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系，北京 100005)

核酸检测在疾病筛查、用药指导、预后判断和监测等方面扮演重要角色，在新型冠状病毒病(corona virus disease,COVID-19)的防控、筛查、治疗过程中体现得淋漓尽致[1-2]。其中聚合酶链式反应(PCR)和反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)一直是实验室进行分子诊断和病原学检测的金标准[3]，PCR方法以其高灵敏度和高特异性这一特点被广泛使用，然而这种方法需要高昂的成本，需要基于实验室的设备和专业知识，应用到现场检测需要克服许多不利因素，因此研究人员逐渐将目光转向利用单一温度进行扩增的技术[4-5]。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是21世纪发展起来的一种新颖的等温核酸扩增技术，与普通PCR比起来不需要温度控制精确的模块体系，恒温完成扩增，具有高灵敏度，高特异性和快速扩增的优点[6-8]。现在发展成不依赖昂贵的PCR仪就能实现现场高通量快速检测的一种方法，检测成本远低于荧光定量PCR,可作为快速简便的诊断方法来检测和识别病原微生物感染[9]。本研究拟建立一种基于磁珠捕获的免提核酸环介导恒温扩增技术CLIP-LAMP (capture and ligation probe-LAMP)，能够快速、简便地进行大体积病原体检测。

1 材料与方法

1.1 材料

主要试剂：1 μmol/L链霉亲和素磁珠(Invitrogen公司)； T4 多聚核苷酸激酶、BstDNA 聚合酶大片段和1× ThermoPol 反应缓冲液(New England Biolabs， NEB 公司)；裂解液、洗液(Diacutate 公司)；T4 DNA 连接酶(北京康为世纪生物科技有限公司);甜菜碱(Sigma-Aldrich公司)； dNTPS [宝日医生物技术(北京)有限公司]； SYBR Green Ⅰ(厦门致善生物科技股份有限公司)； BSA(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫缺陷病(human immunodeficiency virus，HIV)检测模板体外转录(invitrotranscription,IVT)制备：查阅文献资料，登录pubmed下载主要在中国流行的 HIV-1型的 CRF07-BC、 CRF08-BC和 CRF01-AE 亚型，找到gag和pol基因，选取3种亚型共有的保守序列导入 pcDNA3.1(+) 质粒载体中，摇菌扩大培养，提质粒酶切为线性，然后反转录为 RNA 进一步纯化，最后测浓度定量， IVT从 1.0×105CPs(copies)/μL梯度稀释到1.28 CPs /μL，呈5倍稀释作为 HIV 检测模板进行后续试验。

1.2.2 磁珠偶联寡核苷酸制备：文献中提到磁珠通过修饰链霉亲和素可与被生物素标记的寡核苷酸连接，从而起到捕获靶标的效果[10-11]，且磁珠自身有富集大体积样品的优势。选取粒径大小1 μm 的链霉亲和素磁珠，与被biotin修饰的寡核苷酸探针结合。取1 mg(1 μmol/L)磁珠到1.5 mL 离心管中，去上清并用2×结合缓冲洗1遍，加200 μL缓冲液重悬，加入20 μL 100 μmol/L 探针和180 μL 水室温振荡30 min，随后1×结合缓冲洗3遍，用1 mL 水重悬即可使用。

1.2.3 捕获探针设计和检测：以上面保守序列为模板，根据特定设置条件挑选捕获和检测探针，检测探针设计成带有茎环结构的序列，所有探针和引物均从生工公司订购。

1.2.4 基于磁珠 CLIP-LAMP 实验方法：此实验中分为捕获靶标、连接探针、荧光检测定量3步进行。在1.5 mL 离心管中加入捕获体系300 μL，1 μmol/L偶联寡核苷酸磁珠30 μL，探针终浓度100 nmol/L，在特定的盐离子浓度下，磁珠连接捕获探针特异性捕获靶标；置于金属振荡仪器中55 ℃，12 000 r/min，1 h 进行捕获反应。捕获结束将离心管放置到磁力架上，通过磁场吸附磁珠去除废液，加入1×washing buffer后用涡旋仪振荡混匀；再放到磁力架去除洗液，重复两次，加入连接体系50 μL (含有2 μL 的5×106U/L的 T4 DNA 连接酶，10 μL 的5×ligation buffer)，涡旋仪混匀放入金属振荡仪器中37 ℃，300 r/min，10 min即可完成连接反应。将离心管拿出置于磁力架上，去除连接体系，加入25 μL最终恒温扩增LAMP体系(含有甜菜碱，前端引物FIP，后端引物BIP，dNTP，BstDNA 聚合酶大片段， SYBR Green Ⅰ，由20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L(NH4)2SO4、 2 mmol/L MgSO4和0.1% Triton X-100, pH 8.8组成的1×ThermoPol buffer),混匀后转入96孔板中置于荧光定量PCR仪中进行LAMP扩增，恒温65 ℃扩增45 min，每分钟采集1次荧光信号记录荧光信号变化。整个过程如图1所示。

SA.streptavidin; FIP,BIP.LAMP primer; MNPs.magnetic beads; A.hybridization between streptavidin-coated magnetic beads and biotin-labeled DNA molecules; B.CLIP-LAMP schematic diagram

2 结果

2.1 实验优化结果

2.1.1 BSA (bovine serum albumin) 对LAMP 反应阶段的影响： BSA 加入最后 LAMP 反应可以对磁珠状态的稳定起到一定作用，比较 10、7、4 和1 mg/mL的 BSA 溶液，通过实验得出1 mg/mL的 BSA 使得反应速度加快，效果最好(表1，图2)。

表1 不同浓度BSA 的检测结果

CPs.copies; Cq.quantification cycle;*P<0.05 compared with NTC group; NTC.no template control图2 CLIP-LAMP反应中BSA的优化Fig 2 Optimization of BSA in CLIP-LAMP reaction

2.1.2 磁珠捕获体积递增实验：选取2×104和4×103CPs/μL两种IVT 样品进行实验，捕获体积分别为100 μL、200 μL、500 μL和1 mL，捕获体积越大，此方法的灵敏度越低(表2，图3)。

表2 不同捕获体积检测结果

CPs.copies; Cq.quantification cycle图3 磁珠捕获体积递增试验Fig 3 Capture volume of magnetic beads increasing

2.2 基于磁珠CLIP-LAMP检测HIV的IVT灵敏度分析

将HIV的IVT从1×105CPs/μL至32 CPs/μL依次进行5倍梯度稀释，以IVT浓度的对数值为横坐标，测得的Cq值(扩增达到荧光阈值时所经历的时间)为纵坐标，绘制标准曲线图，线性关系良好，R2=0.94，可以稳定测到32 CPs/μL的IVT(图4)。

2.3 基于磁珠CLIP-LAMP检测HIV的IVT特异性分析

基于磁珠CLIP-LAMP 检测 HIV 的 IVT 的特异性评估如5图所示， positive control选择的是4×103CPs/μL的 IVT 样本， negtive control 选择的是健康的人血样本，NTC(no template control)是未加模板的对照。图中可以看出，此方法只在 IVT 样品中准确检测出信号，在健康人血中和NTC中未检测出信号，特异性良好。

2.4 基于磁珠CLIP-LAMP检测HIV的IVT的重复性分析

IVT浓度从1×105CPs/μL到32 CPs/μL的变化中，Cq值的变异系数(coefficient of variation，CV)均小于5%，表明数据真实有效(表3)。

表3 磁珠CLIP-LAMP的重复性

3 讨论

本研究基于磁珠捕获免核酸提取环介导恒温扩增的方法成功建立，通过免提核酸使用磁珠富集靶标核苷酸可以轻松处理大体积样本，免提核酸避免了繁琐的核酸提取步骤以及提取过程中的损失，普通96孔板可裂解处理样品50 μL，而磁珠可以在1.5 mL的离心管中裂解富集1 mL的样品，因而大体积富集有能力达到较低的灵敏度，本研究的灵敏度还可以通过改变磁珠偶联核酸方式得到提升，后续优化有潜力达到更低的灵敏度。LAMP检测对设备没有特殊要求，不需要昂贵的PCR仪器，仅需要简单的恒温扩增仪器恒温保持30～60 min即可,这一优势决定其对各种应用场景接纳度高，受限小。

本研究方法与普通LAMP方法比较具有更强的特异性，常规LAMP引物只能针对一个位点进行设计扩增，本方法的CLIP-LAMP可以针对一段较长的靶标检测区域设计多对检测探针同时进行扩增反应，检测探针覆盖域更长，所以检测较常规LAMP更加灵敏。其次一对检测探针中间的连接步骤也进一步增强了检测的特异性，弥补了常规LAMP容易出现的假阳性问题。检测探针的茎环结构尾巴是通用的，可以仅替换检测靶标序列达到检测不同病原体的效果。

CPs.copies; Cq.quantification cycle图4 磁珠CLIP-LAMP检测HIV的IVT的实时荧光曲线和线性关系Fig 4 HIV detection sensitivity and dynamic range of CLIP-LAMP on magnetic beads n=3)

图5 磁珠CLIP-LAMP检测HIV体外转录(IVT)的特异性Fig 5 HIV detection specificity of CLIP-LAMP for in vitro transcription(IVT) magnetic beads

国内艾滋病形势较为严峻，目前有效消除艾滋病最重要的环节就是控制艾滋病的传播，大规模进行重点人群艾滋病的检测并且尽早地发现感染者是重中之重，本研究建立的基于磁珠CLIP-LAMP方法可以稳定检测到32 CPs/μL的HIV IVT浓度，并在将来通过进一步优化达到更低的浓度。综上所述，本研究成功建立起基于磁珠免核酸提取恒温扩增技术，为HIV检测带来新的思路和方法。