TRIM15表达水平与胃癌患者病理特征及近期预后的相关性

崔兆勋，魏 强，安家祯，任亚婵，袁通晓，王 琛，刘 瑜

（陕西省森工医院 1.肿瘤科；2.普外科，西安 710300；3.陕西省肿瘤医院，西安 710061）

胃癌（gastric cancer，GC）是消化道肿瘤中最常见的一类，虽然近年来相关研究较多，进一步完善了GC 患者治疗方案，但仍有部分患者由于病情进展较快等原因导致预后较差及生存时间较短的情况[1-2]。伴随着分子生物学及基因组研究的逐步深入，基因与蛋白在恶性肿瘤疾病发生发展中的影响被逐步揭示，而三结构域蛋白家族（tripartite motif，TRIM）在机体免疫中扮演着重要的角色，既往国内、外多项研究显示其与人体发生的多个恶性肿瘤有着显著的关系[3-4]。TRIM15 是此家族中的一员，其表达与非小细胞肺癌、宫颈癌等多个恶性肿瘤疾病相关，主要是由于其作为调节细胞增殖的E3泛素连接酶，参与到肿瘤细胞的增殖分化过程，从而影响肿瘤疾病的发生发展过程[5]。本研究通过比较TRIM15 在GC 患者中表达水平与病理特征及预后之间的关系，旨在为GC 的诊断及治疗提供新的参考方向。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017 年1 月至2018 年6 月于陕西省森工医院就诊并确诊GC的患者91例。病例纳入标准：（1）符合NCCN2016 年颁布的胃癌临床实践指南中对于GC的诊断且符合手术治疗标准[6]；（2）患者年龄在18 岁以上；（3）首次诊断GC；（4）依从性良好，自愿接受随访。排除标准：（1）既往接受过抗肿瘤治疗；（2）并发有其他组织恶性肿瘤；（3）严重的基础疾病；（4）半月内感染或严重外伤史；（5）免疫系统疾病史；（6）长期免疫调节类药物服用且无法停药。本研究经医院伦理委员会审核批准，且患者及家属签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测（1）组织脱水处理：对术中取下的瘤体组织进行切片，而后进行脱蜡并使用蒸馏水反复冲洗直至切片洁净。（2）封闭内源性过氧化物酶：室温下玻片置于3%过氧化氢液中10 min，并使用山羊血清封闭室温下30 min 对切片进行抗原修复。（3）孵育一抗：PBS冲洗玻片3次，拭去多余水分后滴加50 μL 的1∶300 抗TRIMl5 抗体。滴加一抗后，玻片置于湿盒中在37 ℃温箱中孵育50 min；用正常血清替换一抗作为阴性对照。（4）孵育二抗：用PBS 进行洗涤后，将载玻片与1∶1 000 稀释的生物素标记二抗孵育30 min。（5）显色：使用链霉抗生物素蛋白.辣根过氧化物酶孵育30 min，将二氨基联苯胺用作发色团发色。（6）复染：PBS冲洗后，玻片置于苏木精中约30 s进行细胞核复染。

1.2.2 随访 所有患者出院后按照文献的相关标准进行随访[6]，主要依托于电话及患者来院方式进行随访，时间为2年。

1.3 观察指标及评判标准

1.3.1 免疫组化判断标准 采用半定量法，TRIM15表达水平=染色阳性细胞数比例等级×染色强度等级。表达水平＜6为低表达，≥6为高表达。（1）染色阳性细胞数比例判断方法：于100倍镜下选择10个视野，观察每个视野计数的100 个细胞中的阳性细胞数占比；（2）染色阳性细胞数比例等级判定标准：共分为4 级，其中0 级：阳性细胞＜10%；1 级：阳性细胞10%～25%；2 级：阳性细胞26%～50%；3 级：51%～75%；4 级：76%～100%。（3）染色强度判断标准0 级：无着色；1 级：浅棕色；2 级：棕色；3 级：深棕色。

1.3.2 临床病理参数 包括年龄、性别、瘤体直径、分化程度、浸润深度、转移情况、TMN分期及组织学分型。

1.3.3 预后评价 收集患者随访期间无病生存时间、存活时间、无病生存率及总存活率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以百分率(%)表示，组间比较采用χ2检验；Kaplan-Meier 法分析TRIM15 不同表达量患者预后之间的生存曲线，Log Rank法比较两组患者的无病生存和累积生存风险间的差异；根据无病生存情况对所有患者进行分组后采用COX 回归分析无病生存状态的影响因素，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者分组及病理学特征比较

根据术后病灶免疫组化结果，将患者分为TRIM15 高表达组（n=54）和低表达组（n=37）。高表达组患者T1/T2浸润深度、TMN分期为Ⅰ/Ⅱ占比显著高于低表达组（P＜0.05）；其余病理学特征指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。瘤体组织免疫组化结果，见图1。

图1 瘤体组织免疫组化结果（100×）

表1 患者病理学特征比较

2.2 两组患者无病生存情况评价

91例患者中共计85例完成随访，随访完成率为93.41%。高表达组随访期间累积无病生存率为94.44%，低表达组累积无病生存率为70.27%，高表达组无病生存显著高于低表达组（χ2=10.187；P＜0.05）。Kaplan-Meier生存曲线图，见图2。

图2 两组患者随访期间无病生存率比较

2.3 两组患者累积生存率情况评价

高表达组随访期间累积生存率为98.14%，低表达组累积生存率为83.78%。高表达组总存活率显著高于低表达组（log-rankχ2=6.219；P＜0.05），见图3。

图3 两组患者随访期间生存率情况比较

2.4 GC患者无病生存的单因素分析

将所有完成随访患者按照无病生存情况分为预后良好组（n=71）和预后较差组（n=14），Cox单因素分析显示，瘤体直径和TRIM15 表达水平是影响患者预后的因素（P＜0.05），见表2。

表2 GC患者预后的影响因素分析

2.5 影响无病生存状态的Cox分析结果

以无病生存状态为因变量，以单因素分析P＜0.1的指标为自变量，结合患者时间轴进行Cox回归分析，结果显示，TRIM15是影响患者预后的独立保护因素（HR=0.169，95%CI=0.047～0.607，P＜0.05），见表3。

表3 GC患者预后的影响因素分析

3 讨论

TRIM家族蛋白被定义为RING型E3泛素连接酶家族的一个亚家族，已经被研究发现的成员有60余种，可以调节生物体中广泛的细胞生理过程[7-8]。绝大多数TRIM 家族蛋白均具有3 个特殊结构，首先为RING结构，此结构使得其具有E3泛素连接酶活性，可以与E2 共同作用介导靶蛋白泛素化修饰；其次为TRIM 家族特有的B-box 结构，目前对于此结构的研究尚不明确，但有研究结果显示其可能也是具有E3泛素连接酶活性的结构；最后为卷曲螺旋结构，此为介导TRIM蛋白本身聚集或与其他TRIM蛋白共同作用形成大分子产物，同时还具有特异性亚细胞定位的功能[9-11]。泛素化的蛋白水解途径在许多功能蛋白的降解中起着至关重要的作用，这些与DNA修复、转录调控和细胞信号有关，国内、外多项研究均显示，泛素化修饰在GC 的发生及发展过程中起到了至关重要的作用[12-13]。目前，临床上参与泛素化修饰的多个蛋白，如TWA1、Tensin等均已被证实显著影响GC 患者的预后及病理特征，而TRIM15参与调节非小细胞肺癌及结肠癌的作用也得到了证实，但针对GC与TRIM15之间的关系研究却相对较少[14-16]。

本研究结果提示，TRIM15表达量与GC浸润深度及TMN 分期有相关性（P＜0.05）。根据GC 的发生过程，癌细胞迁移是影响瘤体浸润及扩散的重要因素，而TRIM15包含一个卷曲螺旋结构域，该结构域介导同二聚体、异二聚体以及高阶多聚体相互作用，形成同源多聚成高分子量复合物，在细胞之间起到支架蛋白的作用，并将特异的信号蛋白募集到细胞ECM 粘附位点，从而调节癌细胞的侵袭及转移[17-18]。从以上机制不难看出，TRIM15高表达可以束缚癌细胞像外扩散，从而降低其浸润及扩散的可能性。而GC分化程度及组织学分型可能受其他途径调控，此二者也与GC细胞转移及扩散有关，但可能与TRIM15 介导的细胞黏附作用没有显著关系[19]。肿瘤直径在受到癌细胞扩散影响的同时，也受到细胞分化程度的影响，虽然高表达TRIM15 可以有效抑制细胞转移，但对于癌细胞分化的影响目前尚无证据表明二者之间具有相关性[20]。

通过对比不同TRIM15表达水平患者预后的结果也显示，高表达组无病生存率及生存率均显著高于低表达组（P＜0.05），可能是由于高表达的TRIM15 可以防癌细胞扩散。有研究结果显示，TRIM15参与到了束缚癌细胞扩散的黏附斑的形成过程，此过程中肌动蛋白动力学起到了关键的作用，同时，该研究还指出VASP、FBLIM1、CTTN以及CORO1B是调节肌动蛋白动力学的关键蛋白[21]。在Martinez-Quiles等[22]的研究中指出，CTTN的磷酸化状态对于形成黏附斑的肌动蛋白动力学改变至关重要，当CTTN 被激活后可以与N-WASP 蛋白结合以进行肌动蛋白聚合，而酪氨酸磷酸化抑制NWASP介导的肌动蛋白聚合。最新一项研究中提示TRIM15高表达的细胞中，CTTN蛋白的丝氨酸磷酸化基础水平较高，故说明TRIM15 可能是通过影响CTTN 磷酸化状态达到抑制癌细胞迁移的作用，从而达到改善预后的效果[23]。

在本研究中，TRIM15 表达量是影响患者预后的独立因素（P＜0.05），再次说明了此蛋白在GC 的发展过程中的重要性，但是在Uchil等[24]的研究中指出，虽然TRIM15 虽然是影响细胞黏附作用的重要因素，但其确切机制还有待进一步研究予以确定。同时，既往多个研究中均指出，治疗方案、分化程度、浸润深度及组织学分型等病理特征对于患者预后是显著的[25-26]，但是在本次研究的患者中上述因素分析后并非影响预后的因素，可能是由于本次研究样本量较小、随访时间相对较短所致。既往研究中指出，GC 规范化治疗后患者中位生存期可以达到48 个月[27]，但本次研究由于时间及经费限制，随访时间仅为24个月，显著低于既往研究的中位生存时间，这也是本次研究的问题，故在今后研究中需要进一步延长随访时间。

综上，TRIM15 表达量与GC 患者浸润深度及TNM分期等病理特征以及预后具有显著的相关性，但仍需要进一步研究明确影响机制。