侧脑室注射α-突触核蛋白对黑质和纹状体单胺氧化酶B表达的影响

宓晓晴 谢俊霞 宋宁

[摘要] 目的 探讨侧脑室注射α-突触核蛋白（α-syn）对小鼠黑质和纹状体区单胺氧化酶B（MAO-B）蛋白表达以及运动功能的影响。

方法 将8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为生理盐水组以及0.04、0.20和2.00 ng的α-syn组，给予侧脑室连续注射生理盐水或α-syn共7 d，采用转棒实验检测小鼠运动能力，采用免疫印迹法检测小鼠黑质和纹状体区酪氨酸羟化酶（TH）和MAO-B蛋白表达。

结果 与生理盐水组相比，0.20和2.00 ng的α-syn组小鼠在转棒上运动时间明显缩短（F=4.877，P<0.05），且纹状体区MAO-B蛋白表达水平显著升高（F=9.662，P<0.05），但0.04 ng的α-syn组小鼠运动水平和纹状体区MAO-B蛋白表达水平均没有明显变化（P>0.05）。各组小鼠黑质区TH和MAO-B蛋白表达水平比较差异均无显著性（P>0.05）。

结论 侧脑室注射α-syn可引起小鼠纹状体区MAO-B蛋白表达增加和运动功能障碍。

[关键词] α突触核蛋白;输注，脑室内;纹状体;黑质;单胺氧化酶;小鼠

[中图分类号] R338.2

[文獻标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）05-0642-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.134

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210628.1725.016.html;2021-06-29 10：22：32

EFFECT OF INTRACEREBROVENTRICULAR INJECTION OF Α-SYNUCLEIN ON THE EXPRESSION OF MONOAMINE OXIDASE B IN THE SUBSTANTIA NIGRA AND THE STRIATUM

MI Xiaoqing， XIE Junxia， SONG Ning

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine，  Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of intracerebroventricular injection of α-synuclein （α-syn） on the expression of monoamine oxidase B （MAO-B） in the substantia nigra and the striatum of mice.

Methods Male C57BL/6 mice， aged 8 weeks， were randomly divided into normal saline group and 0.04， 0.20， and 2.00 ng α-syn groups. After intracerebroventricular injection of normal saline or α-syn was given for 7 consecutive days， the rotarod test was used to evaluate motor ability， and Wes-

tern blotting was used to measure the protein expression levels of tyrosine hydroxylase （TH） and MAO-B in the substantia nigra and the striatum of mice.

Results Compared with the normal saline group， the 0.20 and 2.00 ng α-syn groups had a significant reduction in the time spent on the rotating rod （F=4.877，P<0.05） and a significant increase in the protein expression level of MAO-B in the striatum （F=9.662，P<0.05）， while the 0.04 ng α-syn group had no significant changes in motor ability and the protein expression level of MAO-B in the striatum （P>0.05）. There were no significant differences in the protein expression levels of TH and MAO-B in the substantia nigra between these groups （P>0.05）.

Conclusion Intracerebroventricular injection of α-syn can increase the protein expression of MAO-B in the striatum of mice and induce impairment of motor ability.

[KEY WORDS] alpha-synuclein; infusions， intraventricular; corpus striatum; substantia nigra; monoamine oxidase; mice

帕金森病（PD）是第二大常見的神经退行性疾病，其确切病因至今尚未完全明了[1-3]，其主要病理特征为黑质致密部多巴胺（DA）能神经元缺失和路易小体（LB）形成，临床主要表现有肌强直、静止性震颤、运动迟缓以及姿势不稳等[4-7]。α-突触核蛋白（α-syn）是SNCA编码的由140个氨基酸组成的小分子蛋白质，是LB的主要成分[8-10]。大量研究结果表明，PD等突触核蛋白病病人脑脊液中的α-syn水平较正常人显著降低[11-12]。然而，长期追踪调查发现，PD病人脑脊液中的α-syn水平会随着疾病进展逐渐回升，而且α-syn水平的升高与PD病人后期运动功能的下降存在紧密联系[13-14]。单胺氧化酶B（MAO-B）是一种线粒体膜蛋白，是单胺类神经递质的主要氧化脱氨酶，可分解DA产生3，4-二羟基苯基乙醛（DOPAL）等代谢产物[15-16]。有文献报道，α-syn以及α-syn 1～103片段均可直接结合MAO-B而增强其酶活性，最终导致DA能神经元变性[17]。

本文通过给予小鼠侧脑室注射不同浓度α-syn，以评价其运动功能以及纹状体和黑质区MAO-B蛋白表达的变化。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂

实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠，8周龄，体质量（20±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于可自由饮水取食、室温（19±2）℃、湿度（50±5）%、昼夜循环光照（12 h/12 h）的清洁环境中。主要试剂：α-syn购自美国rPeptide公司;酪氨酸羟化酶（TH）一抗购自德国Sigma公司;MAO-B一抗购自美国GeneTex公司;Rabbit Anti-β-actin购自中国博奥森公司;Goat Anti-Rabbit IgG二抗购自中国爱必信公司。

1.2 动物分组与处理

将40只实验小鼠随机分为生理盐水组（A组）以及0.04、0.20和2.00 ng α-syn组（B、C、D组），每组10只。小鼠用异戊烷麻醉后固定在脑立体定位仪上。剪开小鼠颅脑背侧皮肤，用体积分数0.03的过氧化氢溶液擦拭颅骨表面至颅缝和前后囟清晰可见。确定坐标（右侧侧脑室立体定位坐标为前囟后0.3 mm、右旁开1.0 mm、深度2.2 mm）后，将长5.2 mm的套管垂直埋入侧脑室2.2 mm。以1 μL/min的流量注射生理盐水或α-syn 2 μL，每天1次，连续7 d。

1.3 转棒实验

小鼠在旋转棒上适应2 min后，将旋转棒转速设置为4～40 r/min，使小鼠随旋转棒自主运动，记录小鼠在旋转棒上运动的时间。测量2次（间隔30 min）取平均值。

1.4 免疫印迹法检测TH和MAO-B蛋白表达

小鼠断头，根据小鼠大脑图谱取纹状体和黑质样本并称质量。按照25 μL/mg的比例向样本中加入蛋白裂解液，充分研磨后以12 000 r/min离心20 min，取上清，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，加入1/4体积的Loading Buffer后95 ℃金属浴5 min。处理好的蛋白样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜（0.45 μm 的PVDF膜）。以50 g/L的脱脂奶粉室温封闭2 h后加入一抗TH（1∶3 000）、MAO-B（1∶1 000）、β-actin（1∶10 000）4 ℃孵育过夜，次日用山羊抗兔二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，ECL方法显影。用Image J软件分析条带灰度值，TH和MAO-B蛋白表达水平以目的蛋白与内参β-actin条带灰度值的比值来表示。

1.5 统计学处理

应用Prism 5软件进行统计学分析。计量资料以±s形式表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA检验）进行多组均数的比较，继以Tukey方法进行两两均数间的比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 侧脑室注射不同浓度α-syn对小鼠行为学的影响

生理盐水组以及0.04、0.20和2.00 ng α-syn组小鼠在旋转棒上运动的时间分别为（221.867±38.855）、（213.905±63.634）、（145.556±54.844）和（138.111±40.932）s，4组比较差异有统计学意义（F=4.877，P<0.05）。两两比较结果显示，与生理盐水组相比较，0.04 ng α-syn组小鼠运动时间无明显变化（P>0.05），而0.20和2.00 ng α-syn组小鼠的运动时间明显缩短，差异具有统计学意义（q=3.907、4.288，P<0.05）。

2.2 侧脑室注射不同浓度α-syn对纹状体区TH和MAO-B蛋白表达的影响

本研究4组小鼠纹状体区TH蛋白表达比较差异均无统计学意义（P>0.05）。4组小鼠纹状体区MAO-B蛋白表达比较差异有统计学意义（F=9.662，P<0.05）。两两比较结果显示，与生理盐水组相比较，0.04 ng α-syn组小鼠纹状体区MAO-B蛋白表达水平没有明显的变化（P>0.05），0.20和2.00 ng的α-syn组小鼠纹状体区MAO-B蛋白表达水平显著升高（q=4.281、6.993，P<0.05）。见表1。

2.3 侧脑室注射不同浓度α-syn对黑质区TH和MAO-B蛋白表达的影响

本研究4组小鼠黑质区TH和MAO-B蛋白表达比较差异均无统计学意义（P>0.05）。两两比较结果显示，与生理盐水组相比，各浓度α-syn组小鼠黑质区TH和MAO-B蛋白表达水平均没有明显改变（P>0.05）。见表2。

3 讨  论

编码α-syn的SNCA是首個被人们发现的与PD相关的常染色体显性遗传基因[18]。无论是在遗传性PD还是在散发性PD中，α-syn均可以在DA能神经元中积聚形成LB[19]。生理状态下的α-syn与A组比较，F=9.662，*q=4.281、6.993，P<0.05。

通常被认为是舒展的可溶性结构，但当其浓度升高时α-syn易聚合折叠形成寡聚体，对神经元膜有毒性作用，可改变膜渗透性，导致钙大量内流，引起膜除极;也可引起细胞氧化损伤，导致细胞死亡[20]。细胞内的α-syn还可以被释放到细胞外。人的脑脊液和血浆中存在一定浓度的α-syn[21]。大量研究发现，PD病人脑脊液中的α-syn水平降低[11-12]，但随着疾病进展，α-syn水平回升且与病人的认知、运动功能紧密相关[13-14]。

单胺氧化酶是在中枢神经系统和外周神经系统中催化DA、5-羟色胺和去甲肾上腺素等单胺类神经递质的主要氧化脱氨酶。MAO-B通过分解DA产生DOPAL并产生活性氧（ROS）物质和内源性神经毒素[16]。年龄相关的MAO-B表达增加与自由基损伤和ROS增加存在密切关联，可导致神经元线粒体功能降低，导致黑质致密部神经元活力降低以至神经变性[22]。MAO-B抑制剂常被作为有效的PD治疗药物[23-24]。本研究结果表明，侧脑室注射α-syn 7 d可引起C57BL/6小鼠纹状体区MAO-B蛋白表达升高和运动功能障碍，但黑质区MAO-B蛋白表达不变。MAO-B主要位于星形胶质细胞，在星形胶质细胞激活时MAO-B蛋白表达明显上调，因此MAO-B可能作为星形胶质细胞激活的生化标记物[25]。α-syn可以通过Toll样受体4（TLR4）激活星形胶质细胞[26]。因此我们推测，纹状体MAO-B表达升高可能与侧脑室注射的α-syn到达纹状体后激活星形胶质细胞有关，这尚需在后续实验中进一步证实。此外，MAO-B是DA酶解途径之一，当MAO-B表达增加时，一方面MAO-B可促进DA

分解;另一方面，DA分解产生的DOPAL还可以激活δ分泌酶，在N103位置裂解α-syn。α-syn以及α-syn 1～103片段均可直接结合MAO-B而增强其酶活性[17，27]。我们推测，MAO-B表达和活性的增加，可能在未造成DA能神经元损伤之前（本实验观察到黑质和纹状体区TH表达均不变）显著促进了纹状体区DA的分解，造成了小鼠运动功能障碍。与其他脑区相比较，黑质中星形胶质细胞分布相对较少[28]，这可能是侧脑室注射α-syn未引起黑质区MAO-B蛋白表达变化的原因。

综上所述，侧脑室注射α-syn可引起C57BL/6小鼠纹状体区MAO-B蛋白表达增加和运动功能障碍。本文研究结果为进一步探讨脑脊液中α-syn的变化影响PD疾病进程提供了新的实验思路和理论依据。

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（本文編辑 马伟平）