提高益气养血口服液质量标准的研究

李 婵，杨飞快，薛美玲

(1.陕西省药品和疫苗检查中心，西安 710065； 2.金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂，西安 710065)

益气养血口服液是由人参、黄芪、淫羊藿、麦冬、陈皮及当归等13味中药制成的复方制剂，具有益气养血的功效，临床主治气血不足所致的气短心悸、面色不华、体虚乏力。该产品在全国共有24个批准文号，生产企业较多，产品质量差异较大。益气养血口服液的质量标准现执行的是《中国药典》2020年版[1]，其仅对黄芪甲苷和陈皮进行定性鉴别，对淫羊藿药材中的淫羊藿苷进行定量控制。本研究在《中国药典》现行标准的基础上，参考文献方法[2-6]，优化了黄芪的薄层色谱(TLC)鉴别，增加了麦冬的定性鉴别，在原淫羊藿苷含量测定的基础上，增加了朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C，采用一测多评法对4种成分的含量进行测定，为益气养血口服液生产企业在生产过程中实施有效地监督控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 U3000型高效液相色谱仪，UV/DAD检测器，变色龙7工作站，均购自戴安(中国)有限公司；BP211D型电子天平(德国赛多利斯集团)；AS3120型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

1.2试药 黄芪甲苷对照品(批号110781-201717，供含量测定用)，麦冬对照药材(批号121013-201711，供鉴别用)，淫羊藿苷对照品(批号110737-201516，供含量测定用)，均购自中国食品药品检定研究院；朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝霍苷Ⅰ对照品，均购自北京北纳创联生物技术研究院；水为超纯水，自制；甲醇、乙腈为色谱纯，均购自Sigma公司；D101型大孔吸附树脂(西安蓝晓科技新材料科技有限公司)；其余试剂均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。益气养血口服液：通药制药集团股份有限公司(批号191028)，石家庄北方药业集团有限公司(批号191210)，江苏聚荣集团有限公司(批号19081901)，通化万通药业股份有限公司(批号191103)，四平正和制药有限公司(批号191028)，金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂(批号20201201)。黄芪、麦冬等药材购自陕西兴盛德药业有限公司，经西安市食品药品检验所谢志民主任药师鉴定为正品。

2 TLC鉴别

2.1黄芪 取本品20 mL，用水饱和的正丁醇(过夜)振摇提取3次，每次25 mL，合并3次正丁醇液，分别用20、20、15 mL氨试液洗涤3次，合并正丁醇液，蒸干，残渣加入稀乙醇1 mL使之溶解，置于中性氧化铝柱(100～120目，3 g，内径为1.5 cm)上，加体积分数为40%的乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水1 mL使溶解，过D101大孔吸附树脂柱(内径为2.1 cm，柱高为12 cm)，分别加水30 mL、体积分数为40%的乙醇50 mL洗脱，弃去洗脱液，用体积分数为70%的乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，加甲醇1 mL，使残渣溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成质量浓度为0.5 mg·mL-1的对照品溶液；取上述供试品溶液、对照品溶液各5 μL，点于同一硅胶G板上，展开剂为三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)，10 ℃以下放置过夜，取下层溶液展开，取出，晾干，喷以体积分数为10%的硫酸乙醇，在105 ℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的淡紫红色斑点；紫外光365 nm处显相同颜色的荧光斑点。

2.2麦冬 取本品20 mL，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，再加浓盐酸(质量分数为37%)2.5 mL，置于沸水浴上回流1 h，放冷，用二氯甲烷振摇提取2次，每次20 mL，合并二氯甲烷溶液，蒸干，残渣加二氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取麦冬对照药材1 g，加水50 mL，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至10 mL，再加浓盐酸(质量分数为37%)2.5 mL，置于沸水浴上回流1 h，同法制得对照药材溶液。取上述供试品溶液、对照药材溶液各5 μL，点于同一硅胶G板上，展开剂为二氯甲烷-丙酮(4∶1)，展开，取出，喷以体积分数为10%的硫酸乙醇，在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与麦冬对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫黑色斑点。

3 含量测定

3.1淫羊藿苷

3.1.1色谱条件 Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.5 mL· L-1磷酸溶液(26∶74)；检测波长：270 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

3.1.2对照品溶液的制备

3.1.2.1淫羊藿苷对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品10.19 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

3.1.2.2混合对照品溶液的制备 分别精密称取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品10.44、10.11、10.07、10.58 mg，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

3.1.3供试品溶液的制备 取6个不同生产厂家的益气养血口服液，分别精密量取3 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

3.1.4阴性样品溶液 按照益气养血口服液的工艺处方制备不含淫羊藿的阴性样品，再按照3.1.3项下方法制备阴性样品溶液。

3.1.5系统适用性考察 分别取3.1.2.1项下制备的淫羊藿苷对照品溶液、3.1.3项下制备的供试品溶液和3.1.4项下制备的阴性样品溶液，按照3.1.1项下色谱条件测定，记录色谱图。结果表明，在该色谱条件下，淫羊藿苷及相邻色谱峰均可达到基线分离，各峰之间分离度均大于1.5，淫羊藿苷的理论塔板数按照淫羊藿苷峰计算应不低于2 500，阴性样品无干扰。

3.1.6淫羊藿苷含量测定结果 取市售6个不同厂家生产的益气养血口服液，按照含量测定项下方法进行测定，现行标准要求本品每1 mL含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H46O15)计，不得少于0.12 mg；由表1可知，6批样品中淫羊藿苷的含量测定结果均符合规定，结果见表1。

表1 不同生产企业益气养血口服液中淫羊藿苷的含量测定结果 (n=2)

3.1.7供试品溶液色谱图分析 在供试品溶液色谱图中，淫羊藿苷色谱峰峰形较好，与其相邻色谱峰的分离度高。此外，该色谱图中有多个峰形好、分离度高的色谱峰，经对处方进行分析，并采用对照品进行定位可知，分别为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷。结果见图1。

图1 HPLC图

3.2朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量测定结果

3.2.1外标法

3.2.1.1混合对照品溶液 取3.1.2.2项下制备的混合对照品溶液。

3.2.1.2样品测定结果 取6个不同厂家生产的益气养血口服液，按照3.1.3项下供试品溶液方法进行制备，以混合对照溶液中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C为对照，按照外标法进行计算，样品中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量测定结果见表2。

3.2.2一测多评法

3.2.2.1相对校正因子 一测多评法[7-14]测定益气养血口服液中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量，相对校正因子的测定方法采用标准曲线法，色谱条件及样品处理同3.1项下，以淫羊藿苷为内参物，测得朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的相对校正因子分别为0.826、0.831、0.874。

3.2.2.2样品测定结果 采用相对校正因子计算样品中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量，结果见表2。

3.2.32种方法的结果对比 采用淫羊藿苷单对照一测多评法及多对照外标法[15-16]测定6个不同厂家生产的益气养血口服液中淫羊藿类成分的含量，结果见表2。由表2可知，采用淫羊藿苷单对照一测多评法的测定结果与外标法多对照测定结果基本一致；考虑到朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C对照品价格昂贵且不易购买，因此采用淫羊藿苷单对照一测多评法，其检测效率高，检验成本显著降低。

表2 淫羊藿类成分含量测定结果 (n=2)

4 讨论

目前市场上淫羊藿药材质量差异较大[17-19]，直接影响成品制剂的治疗效果。现行标准中仅测定淫羊藿苷单一成分含量对制剂进行控制，且淫羊藿苷含量限度仅为不低于0.12 mg·mL-1，不能较好地反映成品制剂的质量。

本研究发现，供试品溶液色谱图中，淫羊藿苷前后有多个色谱峰，且峰形较好、分离度高，因此对处方进行分析，并通过对照品定位进行排查，在现有淫羊藿苷含量测定的色谱条件下，对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、陈皮中橙皮苷、淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝霍苷Ⅰ进行定位及筛选，供试品色谱中，最终选择分离度好、峰面积较大的朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C进行研究[20]。

本研究依据《中国药典》2020年版中益气养血口服液质量标准，在不改变淫羊藿苷含量测定色谱条件的基础上，采用一测多评法以价廉的淫羊藿苷为内参物，对供试品中多种成分含量进行测定，避免了外标法需要采用多种对照品才能进行检测的弊端，解决了部分对照品不易采购、企业检测成本高等问题，克服了不同色谱系统操作繁琐、检测周期长的缺点，可同时实现中药制剂产品多组分内代表性成分的快速检测，因此可供各生产企业用于益气养血口服液中多种成分的检测与监控[4,6，20]。

原检验方法中供试品取样量为10 mL，用5 mL水饱和的正丁醇萃取，用氨试液洗涤后，需要通过中性氧化铝、D101大孔吸附树脂，操作过程复杂，程序较多，不易检出黄芪甲苷。本研究优化了黄芪甲苷的TLC法，保证了一次检出成功率；同时在原鉴别的基础上增加了麦冬的TLC法鉴别，提高了其质量标准。