黄连解毒汤抗新型冠状病毒肺炎的“中药-成分-靶点”调控网络研究

吉米丽汗·司马依，买买提明·努尔买买提，艾尼瓦尔·吾买尔，周文婷*

(1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学维吾尔医学院，乌鲁木齐 830011)

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)具有较高的传染性和人群易感性，目前全球防控形势严峻，对全球公共卫生事业造成了严重威胁。新型冠状病毒(原名2019-nCoV，现名SARS-CoV-2)主要侵犯呼吸系统，表现为发烧、呼吸困难、乏力和咳嗽等[1]。其与SARS样冠状病毒在致病机制和临床表现等方面有较大的相似性[2]。SARS-CoV-2可与血管紧张素转化酶Ⅱ(ACE2)结合进入细胞造成感染。SARS-CoV-2进入宿主细胞后，释放核糖核酸(RNA)与细胞中核糖体集合，翻译出小核糖核酸病毒的3C蛋白酶(3CLpro)[3-4]。因此ACE2和3CLpro在SARS-CoV-2的致病过程中起关键作用。

黄连解毒汤是纯中药制剂，由黄连、黄芩、黄柏和栀子4味中药组成，具有清热泻火解毒功效，主治实热火毒、三焦热盛之证。研究表明，黄连解毒汤具有明显的抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗内毒素、抗炎等作用，是治疗急性感染性疾病的有效药物[5-7]，现已录入《关于印发新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》中。本研究基于ADME参数和Lipinski规则对黄连解毒汤的活性成分进行进一步筛选，将其活性成分作为匹配库，以3CLpro和ACE2作为分子对接的受体，采用AutoDock分子进行分子对接，并通过在线软件对活性成分及其靶点进行基因功能及信号通路分析，为黄连解毒汤治疗COVID-19的作用及机制提供参考。

1 资料与方法

1.1数据库及分析软件

1.1.1数据库 中药系统药理学数据库(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，中药综合数据库(TCMID)(http://bionet.ncpid.org/)，中药分子机制的生物信息学分析数据库(BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，蛋白质(Uniprot)数据库(https://www.uniprot.org/)，富集分析数据库(DAVID6.8)(https://david.ncifcrf.gov/)，PubMed数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，蛋白结构数据库(PDB)(https://www.rcsb.org)。

1.1.2分析软件 Cytoscape3.7.1软件(https://cytoscape.org)，Schrodinger软件(https://www.schrodinger.com)，Chemdraw16.0软件(https://www.chemdraw.com.cn)，PyMol软件(https://pymol.org/)，Autodock Vina1.2软件(http://vina.scripps.edu/index.html)。

1.2基于ADME和“Lipinski 规则”评估 黄连解毒汤的4味草药通过TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM数据库进行成分的获取。本研究利用“Lipinski规则”，即相对分子质量(MW)、脂水分配系数(AlogP)、氢键供体数(Hdon)、氢键受体数(Hacc)和旋转键(RBN)筛选其活性成分[8-9]。实践表明，“Lipinski 规则”在使用上有局限性，因此5项原则现已简化为3规则和4规则。本文以AlogP<5、Hdon<5和Hacc<10为标准进行筛选。为了确保黄连解毒汤成分鉴定的准确性和相关性，本研究纳入了西北农林科技大学系统药理学实验室(陕西杨凌)的筛选标准[10]，即药物口服生物利用度(OB)≥30和类药性(DL)≥0.18。DL具有良好物理化学性质及生物学特性，DL越大，成药性就越高[11]。对于通过口服途径给药的药物，OB是衡量药物进入人体循环系统有效性的重要指标[12]。最后通过Chemical Book数据库对上述成分以mol格式统一保存，在PyMol软件以pdb格式保存。并通过AutoDock Tools 1.5.6程序以pdbqt格式保存，作为对接配体。

1.33CLpro受体的前处理及分子对接 采用AutoTools把2019-nCoV-Mpro(PDB ID：6LU7)和ACE2(PDBID:1R42)晶体结构蛋白以pdbqt为文件保存(添加蛋白的四字代码)，使用Autodock Vina软件对配体与受体进行对接。最后取优势构象进行分析，并用Schrodinger作图。

1.4活性成分对应靶点的预测及筛选 通过TCMSP数据库筛选能与2个受体具有较好结合能的活性成分对应的靶点。并将黄连解毒汤的4味中药、成分和对应的靶点通过Cytoscape 3.7.1软件构建“中药-活性成分-潜在靶点”网络图。

1.5GO基因功能和KEGG通路分析 黄连解毒汤活性成分作用靶点通过DAVID 6.8数据库进行基因功能和信号通路富集分析。

2 结果

2.1活性成分筛选结果 黄连解毒汤的4味中药通过TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM数据库共收集到532个成分，其中黄连54个、黄芩149个、黄柏140个和栀子189个，见表1。并将成分通过以AlogP<5、Hdon<5、Hacc<10、OB≥30和DL≥0.18为标准筛选得到53个活性成分，见表2。

表1 黄连解毒汤4味中药的总成分

表2 黄连解毒汤活性成分的ADME筛选

2.2分子对接分析结果 一般认为配体与受体结合的构象稳定时，能量越低，发生作用的可能性就越大[13]。根据蛋白复合物中配体的坐标以及蛋白活性口袋进行设置，配体设置为柔性，受体设置为刚性，见图1。黄连解毒汤的53个活性成分通过预处理后，只保留了45个成分。为了提高筛选标准，将45个活性成分的最优结合能与目前临床推荐化学药物，即洛匹那韦、利托那韦和瑞德西韦等药物进行对比。45个活性成分与3CLpro进行对接，结果表明，瑞德西韦的最优结合能(-4.9 kcal·mol-1)在3个临床推荐化学药物中最低，于是收集最优结合能小于该药物的30个活性成分。

图1 3CLpro与原配体的三维结构图

通过分子对接证明黄连解毒汤的主要活性成分是否与ACE2结合。为了提高筛选标准，将45个活性成分与ACE2的最优结合能与TCMSP数据库中以“Angiotensin-converting enzyme 2”为关键词筛选得到的中药成分葛根素结合能进行对比。结果表明，葛根素的最优结合能为-3.8 kcal·mol-1，于是收集最优结合能小于该成分的11个活性成分。45个活性成分中，3CLpro和ACE2与11个活性成分结合能均较高，见表3。由表3可知，氢键和π-π相互作用对配体与受体的识别和稳定性起着关键作用。

2.3活性成分对应的作用靶点的预测及筛选结果 11个主要活性成分运用TCMSP数据库筛选其对应的203个靶点，删除重复靶点后，得到101个靶点。见表3。11个活性成分中穆坪马兜铃酰胺和黄柏酮从TCMSP数据库中未查到其作用靶点，为了避免收载标准和算法不同的问题，删去这2个成分，见图2。由图2可知，黄连解毒汤的4味中药、9个活性成分和101个作用靶点之间的关系，该多维网络由116个节点和213个边缘组成。HB(蓝色四角形)、C(黄色八角形)和T(红色圆形)之间的边缘代表相互作用。节点的大小与度数成正比。节点的度(Degree)越大则其参与的生物功能越多，其生物学重要性越强[14]。该网络中，每个活性成分平均与3.95个靶点相互作用，每个靶点平均与2.2个活性成分相互作用，因此黄连解毒汤中存在1个活性成分与多靶点作用，同时也存在不同活性成分共同作用于同1靶点的现象，这体现了中药多成分与多靶点之间共同作用的机制。由图2可知，PIK3CG(Degree=7)、Akt1(Degree=7)、PTGS1(Degree=6)和PTGS2(Degree=5)等靶点在多维网络中占据重要地位。

图2 中药-活性成分-潜在靶点网络

表3 黄连解毒汤活性成分与3CLpro和ACE2的分子对接结果

2.4GO基因功能和KEGG通路分析结果 将101个作用靶点通过DAVID 6.8数据库进行基因生物学过程和信号通路富集分析，以系统地解释黄连解毒汤抗COVID-19的作用。结果显示，作用靶点涉及651条目生物过程(BP)、144条目分子功能(MF)、71条目细胞组分[15](CC)以及130条KEGG信号通路，见表4。错误发现率(FDR)在富集分析中越小，代表富集显著程度越高,以FDR≤0.01为筛选标准，结果见表4和表5。KEGG信号通路主要包括肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、缺氧诱导因子(HIF-1)信号通路、Toll样受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、p53信号通路、T细胞受体信号通路、细胞凋亡、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、B细胞受体信号通路、核因子κB(NF-κB)信号通路、核苷酸结合寡聚体结构域蛋白(NOD)样受体信号通路11条与人体识别病原体相关的信号通路，并有产生炎性免疫反应有关的信号通路，HTLV-Ⅰ感染和A型流感等病原微生物相关的信号通路以及小细胞肺癌和非小细胞肺癌信号通路等。信号通路在富集分析中越大，表示富集显著程度越高。

表4 黄连解毒汤有效成分的GO基因功能分析

表5 黄连解毒汤中前16个显著富集的KEGG通路(FDR≤0.01)

3 讨论

中医认为COVID-19属于“湿毒疫”范畴，源于感受“湿毒之邪”致病。在中医“辨证施治”理论指导下，中药在“湿毒疫”的运用中具有独特的优势[16]。本文运用中药网络药理学方法，在黄连解毒汤活性成分ADME和Lipinski规则的基础上，结合各种中药的法定质量控制指标，筛选、整合、分析并建立可靠的成分库。以COVID-19为疾病模型，构建相应的中药药理网络。研究报道，在对我国各地区中医药诊疗方案进行分析中，黄连解毒汤应用频次为9次[17]；近20年抗病毒中药文献研究结果显示，黄芩和黄连2味中药使用频次排名前6，且黄连解毒汤被推荐用于治疗邪热壅肺型疾病[18]。

本文以瑞德西韦的结合能≤-4.9 kcal·mol-1作为标准，筛选出与2019-nCoV-Mpro具有较好的结合活性的成分有30个，来自黄柏、黄芩、黄连和栀子的各有12、11、6、6个(其中包含重复的成分)。以葛根素的结合能≤-3.8 kcal·mol-1作为筛选标准得到11个活性成分。其中的黄芩素、表小檗碱、千层纸黄素A、汉黄芩素和荠苎黄酮来自黄芩，白屈菜红碱、黄柏酮、thalifendine来自黄柏，表小檗碱、穆坪马兜铃酰胺、黄柏酮来自黄连，异欧前胡素和山柰酚来自栀子。这11个活性成分与2019-nCoV-Mpro具有较好的结合活性。但其是否直接作用于3CLpro，从而阻断病毒增殖，是否直接作用于宿主细胞，提高机体免疫力，阻断病毒侵袭，需要进一步研究。

KEGG结果表明，与病毒最为相关的PI3K-Akt信号通路、与病毒天然免疫应答相关的信号通路Toll样受体信号通路及与肺部最为相关的小细胞肺癌和非小细胞肺癌均涉及PIK3CG和Akt1，且在HB-C-T网络中Degree均最大，表示其生物学重要性越强。此外，以上主要信号通路中PI3K-Akt 信号通路在富集分析中FDR最小，表示富集显著程度最高。近期研究报道[19]，PI3K抑制剂对A型流感病毒感染诱导病毒性肺炎小鼠肺组织中一氧化氮(NO)生成和炎症反应具有抑制作用。对活性成分而言，黄连解毒汤主要活性成分山柰酚和黄芩素均作用于PIK3CG和Akt1。黄芩素通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路逆转人肺癌细胞A549耐顺铂株细胞的上皮间质转化(EMT)以及抑制抗凋亡蛋白表达[20]。此外，山柰酚通过减轻氧化应激以及显著降低支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)等炎症因子，抑制NF-κB信号通路，从而对病毒诱导的急性肺损伤小鼠产生保护作用[21]。进一步推测，黄连解毒汤活性成分是否作用于PIK3CG和Akt1，减轻氧化应激和炎症作用，从而起到辅助治疗COVID-19的作用。缺氧信号是人类肿瘤病毒编码的毒蛋白可篡改的宿主细胞，可分为缺氧微环境应激和缺氧诱导因子(HIF)信号，两者在致病过程中相辅相成、密不可分[22]。研究报道，千层纸黄素A抑制非小细胞肺癌的侵袭和迁移[23]。并且在低氧微环境下，HIF-1α表达增高具有促进小细胞肺癌的增殖及血管生成的潜能[24]，而千层纸黄素A通过抑制HIF-1α可以预防疾病[25]。千层纸黄素A是否调控肿瘤病毒介导的缺氧信号，从而治疗小细胞肺癌和非小细胞肺癌的作用需要进一步研究。此外，除了以上主要活性成分以外的其他活性成分研究报道较少，需要进一步研究。鉴于网络药理学和分子对接的限制性，需要开展实验研究，为黄连解毒汤抗COVID-19的作用以及后期的药物开发提供理论和实验依据。