Notch1调控PTEN表达对非小细胞肺癌细胞干性及阿霉素耐药性的影响

张媛媛,马 静,何会娜,郭 银,李香兰,池 菲(河北省胸科医院急诊科,石家庄 0500;河北省胸科医院消化内科;河北省胸科医院护理部;河北医科大学第四医院放疗科;通讯作者,E-mail:chi-fei@6.com)

肺癌是全球人类癌症相关死亡的首要原因,而其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌85%左右,尽管手术及化疗对其治疗具有一定疗效,但患者预后5年生存率仍然令人担忧,造成该结果的主要原因是肿瘤转移和耐药性的产生[1]。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)具有自我更新、分化能力,并且对常规放化疗药物治疗具有强大耐药性及促进癌细胞迁移的能力,且与患者的复发密切相关,因此有必要对NSCLC细胞干性及耐药性机制进行深入研究[1]。人第10号染色体缺失的磷酸酶(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)作为肿瘤抑制基因,已被证明其与癌细胞迁移、增殖及化学耐药性有关[2-4]。研究发现,在NSCLC PTEN水平显著下调;PTEN过表达可抑制肺癌细胞顺铂、厄洛替尼等药物耐药性以及细胞干性[4-7]。Notch信号传导途径是一个进化高度保守的信号转导网络,可用于决定细胞增殖、凋亡和分化,研究发现NSCLC中,Notch1的表达显著增加[8]。有研究发现,在NSCLC细胞中Notch1可通过抑制PTEN表达来促进癌细胞的增殖[9]。但Notch1是否可通过调控PTEN表达对NSCLC细胞干性及耐药性产生影响还未可知,因此本研究通过对其进行探究,以期为NSCLC的细胞干性及耐药机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

盐酸多柔比星(阿霉素)(25 mg/瓶，货号：D8740)购自北京索莱宝科技有限公司；青霉素-链霉素(货号：LM1200K)购自上海联迈生物工程有限公司；胰酶溶液(货号：PYG0065)购自武汉博士德生物工程有限公司；非小细胞肺癌A549细胞、胎牛血清、DMEM培养基(货号：YCL-0016、164210-500、PM150210)购自武汉益普生物科技有限公司；MTT检测试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗抗体(货号：BTN111105、K12862、WE0381-QAN)购自北京百奥莱博科技有限公司；蛋白提取试剂盒(货号：CD-13559-ML)购自武汉纯度生物科技有限公司；兔抗β-actin、PTEN(货号：4970、9559)购自Cell Signaling Technology；兔抗c-Myc、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)、基质金属蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2，MMP-2)、八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor，OCT4)、CD133、醛脱氢酶1A1(aldehyde dehydroge-nase 1A1，ALDH1A1)抗体(货号：ab32072、ab16663、ab76003、ab37150、ab19857、ab19898、ab52492)购自abcam；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(货号：11668027)购自赛默飞世尔科技；即用型荧光定量PCR试剂盒(货号：XY-TE-0731)购自上海烜雅生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒(货号：AR1200-100T)购自上海吉至生化科技有限公司；QIAGEN反转录试剂盒(货号：QIAGEN)购自上海科敏生物科技有限公司。

QuantStudio 3 & 5实时荧光定量PCR系统、iBright蛋白免疫印迹成像系统购自赛默飞世尔科技。

1.2 A549细胞培养

将A549细胞接种到DMEM培养基后置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养,两天更换一次培养基直至细胞融合至80%左右时用胰酶消化进行传代培养。

1.3 A549细胞转染

设置对照组、NC-shRNA组、Notch1-shRNA组、Notch1-shRNA+bpV(phen)组,取A549细胞接种到6孔板中,以密度为2×106培养至细胞贴壁后,每组5个复孔,根据LipofectamineTM2000说明书以5 nmol/L为最终浓度将NC-shRNA转染至NC-shRNA组细胞中,Notch1-shRNA转染至Notch1-shRNA组细胞中,Notch1-shRNA+bpV(phen)组细胞经Notch1-shRNA转染后添加100 nmol/L PTEN抑制剂bpV(phen)[10]培养48 h,用荧光显微镜观察转染效果并检测Notch1表达情况。

1.4 qRT-PCR法检测A549细胞中Notch1 mRNA表达情况

使用RNA提取试剂盒提取各组细胞样本总RNA后反转录为cDNA,并以此为模板通过qRT-PCR检测Notch1表达量;β-actin作为内参对其进行标准化,2-ΔΔCt分析其表达水平(n=5)。Oligo 7和Primer 3.0所设引物见表1,由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.5 肿瘤成球实验分析肿瘤成球率

将培养48 h后的A549以104个/孔的密度接种到添加含有干细胞培养液[DMEM培养液中添加2% B27、肝素5 mg/L、人表皮生长因子(hEGF)20 μg/L及人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10 μg/L]的24孔板中，设置3个复孔，培养10 d后于倒置显微镜下观察(×100)，并记录直径>75 μm的肿瘤个数，肿瘤成球率(%)=(成球个数/接种细胞数)×100%。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力

将培养48 h后的A549细胞以2×105个/ml的密度接种于含有1.5中有效成分培养基的6孔板中,设置3个复孔,培养至细胞融合度达80%左右时,通过用200 μl移液枪枪头划痕后吸去培养基除去死细胞,再加入无血清培养基培养48 h观察A549细胞迁移情况并用IPP软件测量迁移距离(D):迁移率(%)=(D48 h-D0 h)/D0 h×100%。

1.7 Western blot检测A549细胞内OCT4、CD133、ALDH1A1、PTEN、MMP-9、MMP-2、c-Myc、CyclinD1蛋白表达情况

使用裂解液对A549细胞进行裂解后,用BCA蛋白试剂盒测定各组A549细胞总蛋白含量;SDS-PAGE电泳分离蛋白、低温转至PVDF膜上,脱脂奶粉进行为时1 h的封闭,加入兔抗β-actin、OCT4、CD133、ALDH1A1、PTEN、MMP-9、MMP-2、c-Myc、CyclinD1一抗孵育(4 ℃)过夜后再用二抗孵育2 h,蛋白凝胶成像仪定量分析各蛋白含量(n=5)。

1.8 MTT检测A549细胞活力

活力检测:将各组A549细胞中以1×104个/孔的密度(每孔100 μl,n=5)接种于96孔板中培养48 h后,以20 μl/孔的浓度添加MTT(5 g/L),4 h后弃上清培养液加入DMSO 100 μl,震荡至MTT反应结晶充分溶解后,在570 nm处测定吸光度OD值,计算A549细胞存活率(%)=(OD处理组/OD对照组)×100%。

耐药性检测:在进行48 h培养前每组分别添加0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4 mg/ml阿霉素,其余步骤与活力检测相同,并计算细胞对阿霉素的半抑制浓度(half-inhibitory concentration,IC50),A549增殖抑制率(%)=(1-OD处理组/OD对照组)×l00%;逆转倍数=Notch1-shRNA组IC50/Notch1-shRNA+bpV(phen)组IC50。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 Notch-1转染效率检测

相较于对照组,NC-shRNA组A549细胞中Notch1表达水平无显著变化(P>0.05),Notch1-shRNA组其表达水平显著降低(P<0.05,见图1)。荧光显微镜观察转染效果发现,Notch1-shRNA组绿色荧光强度明显低于NC-shRNA组(见图2)。

与对照组比较,*P<0.05图1 A549细胞中Notch1的表达情况Figure 1 The expression of Notch1 in A549 cells

绿色荧光代表转染强度图2 荧光显微镜观察 Notch-1转染效率 (×100)Figure 2 Observation on Notch-1 transfection efficiency under fluorescence microscope (×100)

2.2 Notch-1对肿瘤成球率的影响

与对照组相比,肿瘤成球率在NC-shRNA组无显著变化(P>0.05),在Notch1-shRNA组显著降低(P<0.05);与Notch1-shRNA组相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)组肿瘤成球率显著增加(P<0.05,见图3,4)。

与对照组比较,*P<0.05;与Notch1-shRNA组比较,#P<0.05图3 Notch-1对肿瘤成球率的影响Figure 3 The influence of Notch-1 on tumor sphere formation rate

图4 Notch-1对肿瘤成球率的影响 (×400)Figure 4 The influence of Notch-1 on tumor sphere formation rate (×400)

2.3 MTT法检测Notch1对细胞增殖的影响

与对照组相比,NC-shRNA组细胞存活率、c-Myc、CyclinD1表达水平无显著变化(P>0.05),Notch1-shRNA组上述指标显著降低(P<0.05);与Notch1-shRNA组相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)组细胞存活率、c-Myc、CyclinD1表达水平显著增加(P<0.05,见表2,图5)。

表2 MTT法检测Notch1对细胞增殖的影响Table 2 Effect of Notch1 on cell proliferation by MTT

图5 Notch1对细胞增殖相关蛋白表达的影响Figure 5 The effect of Notch1 on the expression of cell proliferation-related proteins

2.4 Notch-1对A549细胞迁移的影响

与对照组相比,NC-shRNA组细胞迁移率及MMP-9、MMP-2表达水平无显著变化(P>0.05),Notch1-shRNA组上述指标显著降低(P<0.05);与Notch1-shRNA组相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)组细胞迁移率及MMP-9、MMP-2表达水平显著增加(P<0.05,见表3,图6,7)。

图6 Notch-1对A549细胞迁移的影响Figure 6 The effect of Notch-1 on the migration of A549 cells

图7 Notch-1对A549细胞内迁移相关蛋白表达的影响Figure 7 The effect of Notch-1 on the expression of migration-related proteins in A549 cells

表3 Notch-1对A549细胞迁移的影响Table 3 The effect of Notch-1 on the migration of A549

2.5 Notch-1对细胞干性相关蛋白表达的影响

与对照组相比,NC-shRNA组细胞内OCT4、CD133、ALDH1A1表达水平无显著变化(P>0.05),Notch1-shRNA组上述指标显著降低(P<0.05);与Notch1-shRNA组相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)组细胞内OCT4、CD133、ALDH1A1表达水平显著增加(P<0.05,见图8,表4)。

表4 Notch-1对细胞干性相关蛋白表达的影响Table 4 The effect of Notch-1 on the expression of cell stemness-related

图8 Notch-1对细胞干性相关蛋白表达的影响Figure 8 The effect of Notch-1 on the expression of cell stemness-related proteins

2.6 MTT法检测Notch1对细胞阿霉素耐药性的影响

与对照组相比,NC-shRNA组A549细胞对阿霉素的IC50无显著变化(P>0.05),Notch1-shRNA组IC50显著降低(P<0.05);与Notch1-shRNA组相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)组细胞对阿霉素的IC50则显著增加(P<0.05,见表5,图9),逆转倍数为2.88倍。

图9 MTT法检测Notch1对细胞阿霉素耐药性的影响Figure 9 Effect of Notch1 on cell resistance to adriamycin by MTT method

表5 MTT法检测Notch1对细胞阿霉素耐药性的影响Table 5 Influence of Notch1 on cell resistance to adriamycin by MTT

2.7 Western blot检测各组细胞中PTEN的表达情况

与对照组相比,细胞内PTEN表达水平在NC-shRNA组无显著变化(P>0.05),在Notch1-shRNA组显著增加(P<0.05);与Notch1-shRNA组相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)组细胞内PTEN表达水平显著降低(P<0.05,见表6,图10)。

图10 各组细胞中PTEN的表达情况Figure 10 The expression of PTEN in cells in each group

表6 各组细胞中PTEN的表达情况Table 6 The expression of PTEN in cells in each

3 讨论

NSCLC作为肺癌的主要类型,其患者5年预后不良现象严重,而造成这一现象的主要原因是由于手术及化疗无法根除癌细胞的侵袭性及致死性,除此之外,由于NSCLC对常规化疗药物的耐药性,也使得治疗效果受到极大的限制[11,12]。研究发现CSCs对常规放化疗药物具有强大耐药性及促进癌细胞迁移的能力,其与患者复发密切相关,因此有必要对NSCLC细胞干性及耐药性机制进行深入研究[1]。

Notch1作为最重要细胞信号传导系统Notch途径组成之一,具有促肿瘤作用。近期有相关报道称Notch1与阿霉素等化疗药物耐药性有关,研究表明Notch1高表达使小细胞肺癌(SCLC)对高浓度阿霉素产生耐药性[13];抑制Notch1表达可提高乳腺癌、结肠癌等多种癌症的化疗敏感性[14,15]。研究发现,Notch信号通路还参与调控阿霉素对骨肉瘤细胞中肿瘤干细胞富集的过程[14]。在A549细胞中,Notch1表达沉默可抑制CD133阳性细胞富集,并增加顺铂(CDDP)等药物敏感性[16]。本研究发现与对照组相比,Notch1-shRNA组肿瘤成球率、细胞迁移率、增殖、MMP-9、MMP-2、OCT4、CD133、ALDH1A1、c-Myc、CyclinD1表达水平、阿霉素耐药性降低,该结果表明Notch1表达降低能够抑制A549细胞干性及阿霉素耐药性。

PTEN已被发现可通过调节各种细胞信号通路或被其他上游因子调控,在细胞存活、增殖和凋亡中起重要作用,其表达异常与NSCLC等多种癌症的发病机制有关[17,18]。研究发现,lnc ARSR过表达可通过抑制PTEN表达来促进蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)表达,从而诱导NSCLC细胞的生长和迁移[19]。PTEN过表达可抑制耐吉非替尼的A549细胞的肿瘤成球率[20]。肺腺癌细胞中PTEN过表达可提供A549细胞对多柔比星的敏感性[21]。还有研究发现,PTEN表达沉默与Notch1上调表达可协同促进NSCLC恶性生物学进程[22]。PTEN是p53的下游产物之一,Notch1可通过抑制p53表达来抑制PTEN表达,从而激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)PI3K/AKT信号通路,以此促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移[22]。本研究结果发现,Notch1-shRNA组PTEN水平远高于对照组;本研究参考陆天飞等[10]研究中所用的PTEN抑制剂浓度处理细胞,在Notch1-shRNA成功抑制PTEN表达后,肿瘤成球率、细胞迁移率、增殖、MMP-9、MMP-2、OCT4、CD133、ALDH1A1、c-Myc、CyclinD1表达水平、阿霉素耐药性部分恢复,提示PTEN可逆转Notch1沉默降低A549细胞干性及阿霉素耐药性作用,Notch1可能通过促进PTEN表达发挥此作用。

综上所述,Notch1可通过促进PTEN表达抑制A549细胞干性及阿霉素耐药性,本研究不仅对NSCLC细胞干性及其耐药性机制的研究具有重要参考价值,还为NSCLC化疗耐药性的靶向治疗机制研究提供了新的参考,但在未来的研究中还需对A549细胞干性与阿霉素耐药性间的关系进行研究,使研究更为完善。