复合益生菌对大菱鲆（Scophthalmus maximus）幼鱼免疫及抗病力的影响

■产启霞 王福强* 憨素连 李 坤

（1.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连 116023；2.大连大学医学院，辽宁大连 116622）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）原产于欧洲，适宜在低温环境生活，是我国北方重要的经济养殖品种之一[1-2]。日益发展的大菱鲆养殖产业面临着患病率高的突出问题，这极大地限制了其产业的发展[3-7]。

益生菌是一种通过改善动物周围环境或增强动物对疾病应答力的活菌制剂[8-10]，已经在水产养殖中得到广泛应用[11-12]。研究表明，芽孢杆菌能显著提高病原菌哈氏弧菌感染虾的成活率[13]，当大菱鲆仔鱼被病原弧菌感染时，乳酸菌能有效降低其死亡率[14]。然而，关于复合益生菌对大菱鲆免疫及抗病力的影响知之甚少。本研究在饲料中添加不同比例的由枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌和酵母菌等复合而成的益生菌，评估其对大菱鲆幼鱼免疫和抗病力的影响，旨在为其在水产养殖中的应用提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用大菱鲆幼鱼由大连天正实业有限公司提供，运往大连海洋大学暂养7 d后在辽宁省水生生物学重点实验室进行试验。

复合益生菌粉由大连阳光白奥科技有限公司提供，由枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis，（6.7±1.8）×107CFU/g]、嗜酸乳杆菌[Lactobacilli acidophilus，（2.1±0.6）×108CFU/g]和酿酒酵母[Saccharomyces cerevisiae，（8.4±2.3）×106CFU/g]组成。活菌数计算采用稀释平板法[15]。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

将375尾体重为(8.94±0.02)g大菱鲆幼鱼随机分成5组：Z0组为对照组，饲喂基础饲料；Z1、Z2、Z3、Z4组为试验组，分别投喂含复合益生菌粉0.2%（2 g/kg）、0.4%（4 g/kg）、0.6%（6 g/kg）、0.8%（8 g/kg）的饲料，每组3个重复，每个重复25尾鱼。所有饲料原料经粉碎后过80目筛，按饲料配方称重，混合均匀，再加入适量的水。用JZL型挤压造粒机（购自常州品正干燥设备有限公司）制作直径为2.0 mm的饲料，在室内阴干后（低于20℃）置于-20℃的冰箱中保存备用。基础日粮组成和营养水平见表1。

表1 基础日粮配方及营养水平（%）

试验在循环控温养殖水槽（100 cm×60 cm×30 cm）中进行，养殖期间全天充气，水温控制在（18±1）℃，pH为7.35～7.42、盐度为30.6‰～31.2‰。每天以幼鱼体重的3%投喂日粮，根据摄食情况适当调整饲喂量，达到饱食投喂，每天饲喂2次（分别为8：00和17：00），投喂后0.5 h清理残饵粪便，并换水1/2，养殖周期为60 d。

1.2.2 样品采集

试验结束前对大菱鲆幼鱼进行24 h饥饿处理，随机从各组中选取5尾大菱鲆，尾静脉取血（3～4 mL），用低温离心机离心（12 000 r/min，15 min）后取血清，置于-80℃超低温保存备用。

1.2.3 免疫指标的测定

大菱鲆血清的溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化力（T-AOC）测定均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒。

1.2.4 攻毒试验

60 d饲养结束后对试验组和对照组的大菱鲆进行为期14 d的攻毒试验，攻毒菌株为迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda），菌株来自大连海洋大学病害实验室。分别从各水槽取13尾鱼，采用腹腔注射法每尾鱼注射0.1 mL菌悬液（1×108CFU/mL），攻毒试验期间大菱鲆停止饲喂，记录各组鱼在7 d和14 d内的累积死亡率。

1.2.5 数据处理与统计

试验使用SPSS 22.0软件和Origin软件进行数据处理与统计分析，在差异显著时，采用Duncan’s法对平均数进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 复合益生菌粉对大菱鲆幼鱼免疫酶活性的影响（见表2）

表2 复合益生菌粉对大菱鲆免疫酶活性的影响(N=3)

由表2可知，与Z0组相比，Z1、Z2、Z3组中的大菱鲆血清ACP活性有增高的趋势，但差异不显著（P>0.05）。Z4组ACP活性和Z0组相比也没有显著差异（P>0.05），但却显著低于Z1、Z2、Z3组（P<0.05）。

Z2组大菱鲆血清AKP活性显著高于Z0组和其他试验组（P<0.05）。Z3组大菱鲆血清LZM活性显著高于Z0组（P<0.05），但和其他试验组差异不显著（P>0.05）。

各试验组的大菱鲆血清CAT活性均显著高于Z0组（P<0.05），Z2、Z3组也显著高于Z1、Z4试验组（P<0.05）。Z1、Z2、Z3组的大菱鲆血清SOD活性显著高于Z0组和Z4组（P<0.05），但Z1、Z2、Z3组之间差异不显著（P>0.05）。

Z1、Z2、Z3组的大菱鲆血清T-AOC显著高于Z0组（P<0.05），且Z3组大菱鲆血清T-AOC也显著高于其他试验组（P<0.05），其他试验组之间差异不显著（P>0.05）。

2.2 复合益生菌粉对大菱鲆幼鱼攻毒试验的影响（见表3、图1）

图1 复合益生菌粉对大菱鲆抗病力的影响

表3 不同复合益生菌粉添加量对攻毒后大菱鲆成活率的影响(N=3，%)

如表3所示，饲料中添加复合益生菌粉对攻毒7 d和14 d的大菱鲆存活率均有影响。Z0组和Z4组在攻毒7 d后，大菱鲆幼鱼的成活率显著低于Z1、Z2、Z3组（P<0.05）。Z0组和Z4组在攻毒14 d后，大菱鲆幼鱼的成活率也显著低于Z1、Z2、Z3组（P<0.05）。

由图1和表3可见，在大菱鲆幼鱼注射迟钝爱德华菌的前5 d，Z1、Z2、Z3组没有死亡，而Z0组和Z4组的大菱鲆死亡率达到35%以上。攻毒7 d后，Z1、Z2、Z3组的大菱鲆幼鱼存活率仍然在90%左右，而Z0组的大菱鲆存活率不到20%。攻毒14 d后，Z0组和Z4组的大菱鲆已幼鱼全部死亡，而Z1、Z2、Z3组的大菱鲆成活率仍然有40%～50%左右。总的趋势是，随着复合益生菌添加量的增加，大菱鲆累积死亡率逐渐下降，达到最小值后又上升。这表明复合益生菌粉对用迟钝爱德华菌攻毒的大菱鲆幼鱼有一定的保护作用。

3 讨论

3.1 复合益生菌粉对大菱鲆幼鱼免疫酶活性的影响

鱼类的非特异性免疫比特异性免疫系统更重要，尤其在抗病能力上更是如此[16]。LZM是水产动物重要的非特异性免疫因子之一，存在于组织、体液和分泌物中。是水生动物对抗传染性病原体至关重要的工具酶[17]。AKP和ACP是溶酶体酶的重要组成部分，在生物体免疫反应中具有重要作用[18]。鱼体内有天然的抗氧化系统，如CAT和SOD等是水生动物重要的抗氧化酶，可通过清除氧自由基来阻止生物分子损伤[19-20]。抑制脂质过氧化产物形成的指标可由TAOC表示[21]。这些免疫相关酶与抗氧化酶作为鱼体免疫系统的组成部分，其活性的高低直接反映了鱼体非特异性免疫防御能力。

研究证实，单种益生菌可以提高水生动物的LZM水平。乳酸乳球菌、清酒乳杆菌、肠膜明串珠菌可以使褐鳟（Salmo trutta）血清LZM水平升高[22]。在饲料中添加高剂量的灭活乳杆菌同样能提高刺参（Apos⁃tichopus japonicus）AKP的活性[23]。凡纳滨对虾（Litope⁃naeus vannamei）日粮中添加枯草芽孢杆菌能显著提高血清SOD和T-AOC活性[24]。把枯草芽孢杆菌直接投入水体中也能提高鱼类的血清T-AOC[25]。这些研究表明益生菌能提高水产动物血清的免疫酶活性。然而，复合益生菌粉是否能够进一步对大菱鲆非特异性免疫防御能力有改善作用仍鲜见报道。本研究表明，饲料中添加复合益生菌粉能够提高大菱鲆血清LZM、ACP、AKP、CAT、SOD活性和T-AOC，尤其是添加量为0.6%时效果最为显著。刺参饲料中添加6 g/kg的复合益生菌显著提高了刺参体腔液的ACP活性，而其他添加量则对ACP活性没有显著影响，投喂复合益生菌组的刺参体腔液中CAT活性与对照组也没有显著差异[26]。这可能与益生菌的种类、试验水产动物种类以及添加量有关。

3.2 复合益生菌粉对大菱鲆抗病力的影响

迟钝爱德华菌是一种能引起水产动物腹水症的致病菌，其在水产养殖中已引起了20多种鱼类患病，如鳗鲡（Anguilla spp）、中华鳖（Trionyx sinensis）、牙鲆（Paralichthys olivaeus）等，造成了巨大损失。本试验发现添加0.2%～0.6%的复合益生菌粉，将攻毒后大菱鲆成活率提高到90%左右，而对照组不到20%。这表明在饲料中添加复合益生菌能增强大菱鲆幼鱼的抗病力。这些结果和徐琴等[27]的研究一致，其发现在中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）养殖中用鳗弧菌攻毒后，添加微生物制剂的3个试验组的中国明对虾存活率都显著高于对照组。同样，用哈维氏弧菌对凡纳滨对虾攻毒后，益生菌组的凡纳滨对虾死亡率显著低于对照组[28]。大菱鲆攻毒后的存活与非特异性免疫酶和抗氧化酶活性的变化趋势基本一致，这有力地表明复合益生菌能通过提高大菱鲆的非特异性免疫防御能力，从而明显改善其生存状况。

4 结论

饲料中添加复合益生菌粉能增强大菱鲆免疫酶活性和抗病力。复合益生菌粉添加量为0.6%时，大菱鲆幼鱼的免疫酶活性和抗病力达到最佳状态。