一例鸭源腺病毒与沙门氏菌混合感染的综合诊断

赵伊然，林淑玲，刘奎昊，耿宁蔚，王思琪，李 宁*，刘思当*

（1.山东农业大学动物科技学院/山东省动物生物工程与疾病防治重点实验/山东省畜禽疫病防制工程 技术研究中心，山东 泰安 271018；2.山东省栖霞市农业农村局，山东 栖霞）

腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）是一种无囊膜的双股DNA病毒，直径大小为60~90 nm[1]。腺病毒根据其抗原结构的不同可以分为3个群，其中I群主要是禽腺病毒，I群禽腺病毒属又分为5个亚群（FadV-A、-B、-C、-D、-E）和12个血清型（FadV-1至 -8a、-8b至 -11）[2]。目前流行的禽腺病毒病主要是由FAdV-4感染所致，且存在其他血清型FAdV及免疫抑制病毒的混合感染，FAdV-4感染引起禽类的心包积液肝炎综合征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS），主要造成肝脏肿大出血[3]，肝细胞的变性坏死且细胞内出现特征性的核内包涵体，该病毒不会直接感染心肌细胞，但是血浆渗出会造成心包积液。

沙门氏菌是一种革兰氏阴性无芽抱杆菌，动物感染后，可呈无症状带菌状态，或出现生产性能下降、腹泻、急性败血症等症状，导致死亡率増加。沙门氏菌血清型众多，至今已经发现了2 500多种[4]，而感染禽类的主要有鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等几个血清型[5]。

近年来，腺病毒在山东、河南等地养殖的肉鸡肉鸭中广泛存在，造成了肉鸡肉鸭生长缓慢、批量死亡等严重问题[6]，给养禽业造成了巨大的经济损失，威胁着养禽业的健康发展[7]。腺病毒感染会造成强免疫抑制，因此经常会引发各种细菌及其他病毒继发感染[8]。为确诊该病，对发病鸭进行了病理剖检观察、病理组织学检查、病原学检测、药敏试验，以及细菌分离鉴定和测序分 析，最终确定了引起该鸭场疫情的病因是腺病毒及沙门氏菌的混合感染。这次诊断给腺病毒及其与其他病原体混合感染的诊断与防治提供了一些经验。

1 材料与方法

1.1 主要试验耗材

Easypure Viral DNA/RNA Kit核酸提取试剂盒、pEASY-T1 Simlie克隆试剂盒，均购自北京全式金生物技术有限公司；Biospin Gel Extraction Kit胶回收试剂盒，购自杭州博日科技有限公司；琼脂糖粉，购自Sigma公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、血琼脂培养基、普通Taq酶、DL 2 000 DNA Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 发病情况

2020年9月，河南省某鸭场饲养的9 000只樱桃谷鸭雏鸭饲养至20日龄时突然发病，大批量死亡，1 d的死亡量最高达到了60余只。部分患病雏鸭死亡前出现精神高度萎靡、排白色稀粪、食欲废绝以及张口呼吸等症状，但大部分发病雏鸭未表现出明显的临床症状就突然死亡。

1.3 病理剖检及组织病理学检测

对病鸭进行病理剖检，观察各脏器病理变化。采集病鸭的肝、脑、心及脾等组织样品，放于10 % 福尔马林溶液中进行固定，然后把固定好的组织进行石蜡切片、HE染色、镜检，观察其病理变化。

1.4 细菌分离鉴定

将接种环用酒精灯高温灭菌后，将病鸭肝脏组织进行无菌取样；接种于普通琼脂培养基和XDL鉴别培养基，在培养箱中37 ℃ 培养24 h；挑取XDL鉴别培养基上的单菌落置于载玻片上，革兰染色后镜检观察细菌染色及形态特征。

1.5 药敏试验

挑取普通培养基上的少量菌于0.2 ml的生理盐水中制成细菌混悬液，用高温灭菌后的涂菌棒将待检细菌混悬液均匀地涂布于平皿培养基表面。将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面，将平皿培养基置于37 ℃ 温箱中培养24 h后，观察效果。

1.6 PCR检测

将采集的病鸭组织样品剪碎后加入灭菌PBS充分研磨，然后置于 −20 ℃ 冰箱中反复冻融3次后，4 ℃ 9 000 r/min离心3 min，从上清液中提取核酸并将其作为模板对临床常见病原进行PCR检测，包括禽流感病毒、黄病毒、圆环病毒、I型鸭肝病毒、Ⅲ型鸭肝病毒、呼肠孤病毒及腺病毒。细菌 16 SsrRNA 通用引物为27 F/1492R。以上引物均为本实验室保存，具体序列见表1。

表1 试验中所用检测引物信息

将提取的核酸反转录为cDNA，采用检测引物进行扩增。PCR扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54~56 ℃ 30 s，72 ℃ 20~35 s，共32个循环；72 ℃ 7 min。产物经1.0 % 琼脂糖凝胶电泳检测，将得到目的片段回收进行T-A克隆，阳性菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。从GenBank中下载22株FAdV序列，具体见表2，5株沙门氏菌序列（KY776577和MT500568.1），2株大肠杆菌序列，通过MEGA6软件中的Maximum Likehood tree方法进行本次分离毒株及菌株的遗传进化分析，同时使用MegAlign软件进行同源性分析。

表2 本研究中使用的FAd V的参考毒株

2 结果与分析

2.1 病理剖检及病理组织学检测

剖检病鸭可见心包有淡黄色积液；肝脏出血肿大；肠道出血性卡他性炎症；脾脏肿大出血。心肌细胞变性，间质有浆液渗出；肝细胞变性坏死，出现核内包涵体；胸腺、脾脏及法氏囊内的淋巴细胞坏死；十二指肠上皮细胞坏死脱落；黏膜固有层出血。

2.2 细菌分离

病料接种到XDL鉴别培养基上可以见到光滑、稍隆起、无色有黑心的菌落。挑取菌落涂片镜检，结果经革兰氏染色后镜检发现有革兰氏阴性的细小长杆菌。

2.3 药敏结果

对培养出来的细菌用7种药物进行药敏试验 药敏检测结果显示细菌对恩诺沙星最敏感，对新霉素，粘杆菌素，林可霉素和氟苯尼考较敏感，对头孢奎肟，磷霉素不敏感。

2.4 PCR鉴定

PCR结果显示AIV、DTMUV、DUCV、GPMV、NDRV均为阴性，仅FadV为阳性。

2.5 腺病毒序列分析

将临床收到的疑似鸭腺病毒分离株命名为SD202009，利用MegAlign进行同源性及进化树分析，结果表明，此次分离的毒株与MK65019 3、KX421404等毒株亲缘关系最近，表明该毒株为腺病毒4型（图1、2）。

图1 分离毒株的遗传进化分析

图2 分离毒株的同源性分析结果

2.6 沙门氏菌序列分析

将分离到的菌株命名为SD202090，利用 MegAlign进行同源性及进化树分析，结果表明，此次分离的菌株与NR044370菌株亲缘关系最近，表明该菌株为沙门氏菌（图3）。

图3 分离菌株的遗传进化分析

3 讨论

禽腺病毒是现在家禽中最常引发疾病的病原微生物之一，研究表明无论是健康的家禽还是患病的家禽体内均可以分离到腺病毒[9]，该病毒可以在家禽体内长期存在，只引起轻微的临床症状，但感染腺病毒会引起免疫抑制，故该病毒常与其他病原体一起造成混合感染[10]。本研究中，发病鸭场20日龄的樱桃谷鸭出现大批量突然死亡，经过一系列的实验室诊断技术，确诊为禽腺病毒4型和沙门氏菌的混合感染。可以推断本次诊断的病鸭先是感染了腺病毒，造成了抵抗力下降继发感染了沙门氏菌后引起鸭群发病和死亡。

根据之前的报道，不同的鸭源腺病毒4型毒株对鸭的致病性不一[11]，该病毒会引起鸭“安卡拉病”，一年四季均可发生，但在冬、夏多发。该病可以感染40日龄以内的鸭，主要感染20~40日龄的鸭，日龄越小发病率和死亡率越高，30日龄以后发病的常会发生混合感染，造成死亡率增加[12]，处于亚健康的青年鸭会出现心包积液，死亡率在30 % 以上。本次诊断的鸭群在20日龄时发病，有着较高的死亡率和发病率，且存在沙门氏菌的混合感染，符合上述鸭安卡拉病的特征。

由于现阶段腺病毒存在大量的隐性感染，给养禽业造成了巨大的威胁。因此，一定要加强对该疾病防控的重视。本次诊断对FadV-4感染和沙门氏菌感染的诊断防控具有一定的指导意义。