两株微生物的Cr（VI）还原特性研究

黄玉喜 程顺利 赫玲玲 肖进彬 任秋鹤 彭子涵 周振 方玉美

（河南省高新技术实业有限公司，郑州 450002）

铬（chromium）是一种常见的化工原料，在制革、铬盐生产、不绣钢加工及油漆和涂料制造业等工业生产中使用极其广泛［1］。我国作为世界上铬盐产量大国，在从事生产活动的同时也产生了大量的含铬废渣和废液，造成了土壤及水资源的重金属污染［2］。铬在自然环境中有Cr（VI）和Cr（III）2种稳定价态。Cr（VI）是强氧化剂，具有较强的毒性，可引发生物诱变、癌变。由于Cr（VI）具有较高的迁移能力，导致其极易对土壤、地表水及地下水造成污染［3］。Cr（III）的毒性远小于Cr（VI），且有研究表明，适量的Cr（III）对人体健康有益，有利于胰岛素发挥作用，维持正常糖代谢，促进造血功能［4］。当环境pH＞5时，Cr（III）则会形成灰绿色的氢氧化铬沉淀，进而大大降低了其迁移能力［5-6］。因此，目前国内外常用的应对铬污染手段大致可分为两类，一类是直接去除Cr（VI）；另一类是将Cr（VI）转化为Cr（III），使铬以沉淀物的形式稳定存在。

在解决铬污染问题上，国内外使用的研究方法以物理法和化学法居多。Selvi等［7］通过活性炭吸附法得到在酸性条件下，当活性炭粒径为125-250 μm时，对 Cr（VI）的吸附量可达 3.46 mg/g。Cavaco等［8］使用离子交换法，有效去除了电镀铬工业废水中残留的Cr（VI）。刘芳［9］指出在重金属还原沉淀的过程中pH的控制极其重要，其采用还原沉淀法探究了几种常用还原剂在还原Cr（VI）过程中的最适pH，简化了工艺流程，降低了还原成本。Frenzel等［10］通过电化学法，使用碳毡电极高效地还原了低浓度的铬酸钠溶液，且研究表明，该方法对铬酸盐的还原成本较常规化学法节省30%。虞少嵚等［11］利用电絮凝法，使含铬废水中总铬和Cr（VI）的去除率均提升到了99.5%，并通过周期转向手段解决电极钝化问题的同时大大降低了反应的电能消耗。尽管如此，传统的物理法及化学法在解决铬污染的过程中始终无法彻底解决能耗高及二次污染等技术难题。

随着微生物学研究的深入，学者们发现某些微生物在自身防御机制的作用下出现Cr（VI）的耐受性，且在其生长代谢过程中可以将Cr（VI）还原 Cr（III）［12］。微生物还原 Cr（VI）由于具有节约能源和无二次污染等特点而逐渐在解决铬污染问题上得到了应用。Romanenko等［13］在1977年首次分离得到具有Cr（VI）还原能力的脱色杆菌（Bac.Dechromaticans）。 随 后 越 来 越 多 的 具 有 Cr（VI）还原能力的细菌类微生物如Bacillus cereus S5.4，Bacillus cereus等，及真菌类微生物如Aspergillus niger、Rhizopus sp.等被陆续报道出来［14-17］。但是未见有关于寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）和胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）还原 Cr（VI）的相关报道，且报道的微生物多见还原能力较低。

本研究以寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌为研究对象，探索其对Cr（VI）的还原能力及还原特性，以期填充可还原Cr（VI）的微生物种类研究空白，丰富微生物法解决铬污染理论体系。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用菌种为购于北纳创联生物技术有限公司的寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）和购于中国农业微生物菌种保藏管理中心的胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）；试验所用药品包括：重铬酸钾（K2Cr2O7，纯度≥99.8%）、二苯碳酰二肼、丙酮、硫酸和磷酸。

LB培养基：蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、酵母浸粉5.0 g、H2O 1 L，pH使用1 mol/L的NaOH调至7.0左右。固体培养基再按1.5%-2.0%的比例加入琼脂粉，121℃高温灭菌 30 min［18］。

菌悬液的制备：在超净工作台中，将保存的寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌分别接种到液体LB培养基中后，置于恒温30℃、转速150 r/min的摇床中，分别培养24和18 h进入对数生长期。

1.2 方法

1.2.1 不同Cr（VI）浓度对菌株生长的影响 向液体LB培养基中加入不同剂量的重铬酸钾储备液，配制梯度Cr（VI）浓度的培养基：50、100、200、400、600、800和1 000 mg/L。将2株对数生长期的微生物以10%的接种量接种至含Cr（VI）培养基，置于恒温30℃、转速150 r/min的摇床中连续培养，每12 h取样一次，检测其中培养液在600 nm出的吸光值及Cr（VI）的浓度。根据Cr（VI）对其的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），考察其对 Cr（VI）的耐受能力［19］。

1.2.2 菌株对Cr（VI）还原量测试 将对数生长期的2株菌株以10%的接种量，分别接种入Cr（VI）浓 度 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140和150 mg/L的LB培养基，置于恒温30℃、转速150 r/min的摇床中进行连续培养72 h，根据其对Cr（VI）的最大还原量，考察其可最大程度还原Cr（VI）的浓度值。

1.2.3 不同初始pH和电子供体对菌株还原Cr（VI）的影响 向液体LB培养基中加入重铬酸钾储备液，配制含有50 mg/L Cr（VI）的液体LB培养基，使用1 mol/L NaOH溶液分别调节不同培养基的初始pH为5、6、7、8和 9，在恒温 30℃、转速150 r/min的摇床中连续培养72 h，每12 h检测一次培养液中Cr（VI）的浓度。

参考在其他种类微生物研究进展中对微生物还原Cr（VI）能力提升较好的电子供体种类［20-21］，将菌株以10%的接种量接种在含有乙酸钠、乳酸钠、葡萄糖（COD=50 mg/L）的液体LB培养基中，在恒温30℃、转速150 r/min的摇床中连续培养72 h，每12 h检测一次培养液中Cr（VI）的浓度。培养基中均含有 50 mg/L 的 Cr（VI），pH=8。

以上试验每个处理设置3个重复。

1.2.4 检测分析方法 采用二苯碳酰二肼分光光度法（GB/T 7467-1987）测定培养基中的Cr（VI）浓度。将样品摇匀后，取5 mL悬浊液，其中3 mL用于OD值的测定，另外2 mL置于离心管中，4 000 r/min离心10 min后，取上清液进行Cr（VI）浓度的测定。

扫描电镜样品制备方法：取1 mL悬浊液置于离心管中4 000 r/min离心10 min，弃上清液后用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，反复清洗2次，进行固定、漂洗、脱水、干燥后，取适量样品，进行离子溅射仪喷金，随后放入扫描电镜（SEM，JSM-6510）样品台观察重铬酸钾胁迫前后的菌体的形貌变化，并拍照记录［22］。

使用X射线光电子能谱仪（XPS，K-alpha 250Xi）进行能谱分析，试验参数：X射线激发源为单色Al Kα（hv=1 486.6 eV），功率150 W，X射线分析区域为400 μm，能量分析器固定透过能为30 eV［23-24］。

1.2.5 数据处理与分析 相关计算公式如下：

式 中 ：ω 为 Cr（VI）的 去 除 率 ；v为 Cr（VI）的还原速率，mg/（L·h）；C0为初始 Cr（VI）的浓度，mg/L；Ct为t时刻Cr（VI）的浓度，mg/L；Δt为还原反应时间，h。使用Image J软件测量微生物长度及直径。相关数据分析使用SPSS 25.0和Origin 8.0软件处理完成。

2 结果

2.1 最小抑菌浓度

通过对Cr（VI）的还原能力的检测，结果表明，2株微生物的生长活性均随Cr（VI）浓度的升高而呈降低趋势（图1），寡养单胞菌在Cr（VI）浓度小于400 mg/L时生长没有影响，且400 mg/L的Cr（VI）浓度胁迫下尚能存活，但是，当Cr（VI）浓度超过400 mg/L时，其生长则受到明显的抑制作用（图1-A）。胶冻样芽孢杆菌在Cr（VI）浓度小于200 mg/L时生长没有影响，且200 mg/L的Cr（VI）浓度胁迫下尚能存活，但是，当Cr（VI）浓度超过200 mg/L时，其生长则受到明显的抑制作用（图1-B）。由此推测，寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌的MIC分别为400和200 mg/L，寡养单胞菌对Cr（VI）的耐受性显著高于胶冻样芽孢杆菌（P＜0.05）。

图1 不同Cr（VI）浓度对微生物生长的影响Fig.1 Effect of different Cr（VI）concentration on the growth of microorganisms

2.2 最大还原量与可完全还原Cr（VI）的最大浓度

两株微生物对Cr（VI）的还原量均随着初始Cr（VI）浓度的升高呈现先增加再减少的趋势。寡养单胞菌在初始Cr（VI）浓度为110 mg/L时，72 h内其还原量达到最大，为60.7 mg/L，Cr（VI）去除率为55.2%（图2-A）。

图2 两株微生物对Cr（VI）的最大还原量Fig.2 Maximum reduction of Cr（VI）by two species of microorganisms

胶冻样芽孢杆菌在初始Cr（VI）浓度为80 mg/L时，72 h内其还原量达到最大，为28.1 mg/L，Cr（VI）去除率为35.1%（图2-B）。寡养单胞菌对Cr（VI）的最大还原量显著大于胶冻样芽孢杆菌（P＜0.05）。初始Cr（VI）浓度的升高一定程度上降低了微生物的活性，进而减弱了其还原Cr（VI）的能力。

由图3可知，2种微生物在低浓度可实现完全还原Cr（VI），随初始Cr（VI）浓度的升高开始出现Cr（VI）的剩余。寡养单胞菌可完全还原的最大Cr（VI）浓度区间为40-50 mg/L，胶冻样芽孢杆菌可完全还原Cr（VI）的最大浓度区间为10-20 mg/L，为探究2株微生物可完全还原的Cr（VI）最大浓度，在上述浓度区间内设置梯度浓度分别接种2菌种，连续培养72 h，每12 h取样一次，最终得到2株微生物可完全还原Cr（VI）的最大浓度（图 4）。

图4 可完全降解最大Cr（VI）浓度Fig.4 Maximum Cr（VI）concentration that can be completely degraded

在反应72 h内，寡养单胞菌可完全还原的最大Cr（VI）浓度为45.5 mg/L，胶冻样芽孢杆菌可完全还原的最大Cr（VI）浓度为18.5 mg/L。对Cr（VI）完全还原的意义在于，对重金属污染处理的彻底性。根据我国污水的排放标准Cr（VI）浓度需小于0.5 mg/L，因此，寡养单胞菌可完全解决50 mg/L以下的Cr（VI）污染。

在还原速率方面，反应48 h内，寡养单胞菌对Cr（VI）的去除率达88.1%，还原速率为0.84 mg/（L·h），胶冻样芽孢杆菌对Cr（VI）的去除率为70.9%，还原速率为0.28 mg/（L·h）。反应48 h内寡养单胞菌的还原速率远大于胶冻样芽孢杆菌，48-72 h间2菌种的还原速率相当，均为0.22 mg/（L·h）。

2.3 初始pH对微生物还原Cr（VI）的影响

设置初始pH分别为5、6、7、8和9，将2菌种按照10%的接种量，分别接种入Cr（VI）浓度50 mg/L的LB培养基中进行连续培养72 h，每12 h取样一次，得到各初始pH条件下微生物对Cr（VI）的去除率（图5）。

图5 初始pH对微生物还原Cr（VI）的影响Fig.5 Effect of initial pH on the reduction of Cr（VI）by microorganisms

初始pH对寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌还原Cr（VI）的影响从优至劣依次均为 ：pH 8＞pH 7＞pH 9＞pH 6＞pH 5。其中，寡养单胞菌还原 Cr（VI）的最适pH为8，反应72 h内对Cr（VI）的去除率达到了98.1%。胶冻样芽孢杆菌还原Cr（VI）的最适pH为7-8，反应72 h内对Cr（VI）的去除率为49.2%，在pH 8的环境下，反应前12 h胶冻样芽孢杆菌的去除率与寡养单胞菌相当，随后去除率始终低于寡养单胞菌。

2.4 不同电子供体对还原速率的影响

通过在反应体系中分别加入乙酸钠、乳酸钠、葡萄糖（COD=50 mg/L），考察不同电子供体对微生物还原Cr（VI）的影响（图6）。

图6 不同电子供体对微生物还原Cr（VI）的影响Fig.6 Effect of different electron donors on the reduction of Cr（VI）by microorganisms

寡养单胞菌在乙酸钠和乳酸钠的作用下还原效率得到了显著提升，仅60 h就达到了100%的去除率，葡萄糖则表现出抑制作用。在胶冻样芽孢杆菌在还原Cr（VI）的过程中，乳酸钠和葡萄糖表现出促进作用，在葡萄糖和乳酸钠的分别作用下，反应72 h内胶冻样芽孢杆菌对50 mg/L的Cr（VI）去除率从49.2%分别提升至61.9%和73.2%，表明乙酸钠和乳酸钠可作为寡养单胞菌还原Cr（VI）的优质碳源，葡萄糖和乳酸钠可作为胶冻样芽孢杆菌还原Cr（VI）的优质碳源。

2.5 寡养单胞菌还原Cr（VI）前、后的SEM分析

选择还原能力较强的寡养单胞菌，对其还原Cr（VI）前、后的形貌进行扫描电镜观察（图7），使用Image J软件测量微生物长度为（3.77±0.19）μm，直径为（1.29±0.07）μm，反应前后细菌大小并未发生明显变化。还原反应前微生物体呈柱状、表面光滑、边缘规则；还原反应后微生物周围包裹有一层膜状物质。

图7 寡养单胞菌还原Cr（VI）前、后形貌扫描电镜图Fig.7 Scanning electron microscopy before and after reduction of Cr（VI）by Stenotrophomonas sp.

2.6 寡养单胞菌还原Cr（VI）的X射线光电子能谱分析

为探究寡养单胞菌还原Cr（VI）的产物组成，采用高性能X射线光电子能谱仪对其还原产物进行表征分析（图8）。图8-A为寡养单胞菌还原产物的XPS全谱图，图中出现典型的C、O、Cr等元素的俄歇谱线和C1s、O1s、Cr2p轨道的特征峰。Cr2p轨道峰显示（图8-B），结合能576-579 eV处和结合能586-589 eV处可见2个明显的出峰，分别为Cr2p3/2轨道和Cr2p1/2轨道。根据XPS标准能谱手册可知，Cr2p3/2轨道处的出峰由Cr（VI）在（578.0±0.1）eV处的出峰和Cr（III）在（576.6±0.1）eV处的出峰叠加而成，Cr2p1/2轨道的结合能比Cr2p3/2轨道高9.9 eV左右。由此可知，菌体表面同时存在Cr（VI）和Cr（Ⅲ），由于不同出峰的面积表示不同价态Cr的相对含量，由图8-b可知，菌体表面的Cr（Ⅲ）含量高于Cr（VI）。

图8 寡养单胞菌还原产物的XPS全谱图和Cr2p轨道峰Fig.8 Full range XPS spectra and spectra of Cr2p for the reduction products of Stenotrophomonas sp.

3 讨论

微生物对Cr（VI）的耐受能力是对Cr（VI）还原能力的最基本条件，而对Cr（VI）的还原量及还原的完全性直接决定了其在实际应用中的价值。据以往文献报道，对Cr（VI）耐受性较高的微生物在Cr（VI）胁迫下的MIC多处在400-800 mg/L，Pal等［25］对从土壤中分离得到的34株土壤微生物检测，发现在Cr（VI）胁迫下的MIC为400-800 mg/L的微生物有27株；刘奎艳等［26］分离得到的土壤微生物在Cr（VI）胁迫下的MIC为500 mg/L。但多数微生物都难以实现对Cr（VI）的完全还原，如Pal分离的bacillus sphaericus AND303可完全还原的Cr（VI）浓度小于10 mg/L。寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌在Cr（VI）胁迫下的MIC分别为400和200 mg/L，表明寡养单胞菌可在高浓度的Cr（VI）污染条件下生存，而胶冻样芽孢杆菌仅可在中高浓度的Cr（VI）污染条件下生存。还原能力方面，寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌可完全还原45.5和18.5 mg/L的Cr（VI），这一性能优于文献报道的耐盐菌Staphylococcus sp.YZ-1 和 Bacillus cereus CC-1［18］。因此，寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌可在高浓度和中高浓度的Cr（VI）污染治理中发挥积极作用。

寡养单胞菌还原Cr（VI）的最适pH为8，反应72 h内对50 mg/L的Cr（VI）的去除率达到了98.1%，杜艳影等［22］在厌氧体系中研究的S.oneidensis MR-1还原50 mg/L的Cr（VI），在反应第7天时的还原率为88%，寡养单胞菌较之表现出更优异的还原能力。另外，寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌均在弱碱性条件下表现出较好的还原性，满足细菌在弱碱性环境中生长状况更好的特点，也表明这2株微生物的还原酶在弱碱性环境中活性最高。微生物在生长代谢过程中，一方面可以利用有机质增强自身活性；另一方面可以从有机质中获取电子以促进其对Cr（VI）的还原作用，因此，合理控制碳源对提升微生物对Cr（VI）还原效率意义重大［27］。本研究以乙酸钠、乳酸钠和葡萄糖分别作为电子供体进行还原能力测试，结果表明乙酸钠和乳酸钠可提升寡养单胞菌的还原能力，葡萄糖和乳酸钠可提升胶冻样芽孢杆菌的还原能力。本结果与郝孔利等［28］对Pichia guilliermondii ZJH-1的研究相一致。乙酸钠作用不明显，推测是由于乙酸作为小分子有机酸会降低溶液的pH，从而抑制了微生物的活性［20］。

本研究通过扫描电镜发现寡养单胞菌在还原Cr（VI）后，细胞膜表面包裹有一层膜状物质，朱文杰等［29］在研究中也发现类似现象，推测是微生物的Cr（VI）还原酶位于细胞膜上。研究表明，微生物机体合成的胞外多糖既可以起到保护机体的作用，也可以吸附Cr（VI）［30］。另外，为了避免较高毒性的Cr（VI）侵害机体，Cr（VI）的还原过程可能多在微生物表面进行［14］。因此，推测寡养单胞菌的还原过程中包含一定程度的吸附作用。研究发现，元素的不同价态离子相应的结合能有所差异，因此可根据其结合能分析元素的价态［22，24，31］。对还原Cr［29］（VI）后的寡养单胞菌进行XPS分析，结果显示寡养单胞菌同时存在Cr（VI）和Cr（Ⅲ），且Cr（Ⅲ）含量高于Cr（VI），表明寡养单胞菌还原Cr（VI）的过程同时包含吸附作用和还原作用，并且还原作用起主要作用，吸附作用起次要作用。

4 结论

寡养单胞菌可有效降解Cr（VI），降解过程包括还原和吸附作用，其中还原作用为主要作用。另外，寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌均可在中高浓度Cr（VI）中保持较高的活性及较强的Cr（VI）解毒性，在偏弱碱性环境下同时施加适量的电子供体还可以有效提高其还原能力。因此，寡养单胞菌和胶冻样芽孢杆菌可作为修复重金属Cr（VI）污染的优质菌种，在解决铬污染问题中发挥重要作用。