长茎葡萄蕨藻胁迫条件下RT-qPCR内参基因的筛选与验证

李恬静薇 邹潇潇 朱军 鲍时翔

（1. 河北农业大学海洋学院，秦皇岛 066000；2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室，海口 571101）

荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）是一种能够实时监测PCR产物扩增并对其进行简单的分析的方法，通过在反应体系中加入荧光物质，监测PCR过程中的荧光信号强度来进行分析。RT-qPCR具有灵敏度高，特异性强、重复性好、操作简单便捷等优点［1-2］。RT-qPCR被广泛应用于基因表达研究中，然而RT-qPCR的准确性受到许多因素的影响，包括RNA样本质量和提取方法的差异，以及反转录和PCR的效率［3-5］，所得的结果需要进行校准后才具有生物学意义。

最常用的RT-qPCR校准方法是使用一个或多个内参基因。内参基因作为参照的基因在各组织细胞中稳定表达，在研究基因的表达水平中常被用作数据的校准，以消除RT-qPCR不同样品的差距和RT-qPCR操作中的误差。最普遍使用的内参基因为内源性参照基因，也叫看家基因（持家基因），在生物体各细胞组织中都能表达，其表达产物是维持细胞生命活动必须的蛋白质，如肌动蛋白（Actin）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、微管蛋白基因（Tubulin）和核糖体蛋白（18S）等。但近年来越来越多的研究发现，这些常用内参基因在不同的物种，不同的组织细胞，不同的发育阶段和实验条件都存在较大的表达差异［6-7］。在拟南芥和杂交白杨不同组织中发现几种常用内参基因（TUB、Actin、UBQ和EF1a）的表达大多不稳定，如果使用不适当的内参基因会直接影响RT-qPCR的结果准确性［8］。因此，在将内参基因用于RT-qPCR校准之前，需要对每个特定实验系统的内参基因的稳定性进行系统的评估。目前，已经开发出了几种用于内参基因筛选的软件如geNorm［9］、NormFinder［10］和 BestKeeper［11］等，可以在给定的实验条件下从一组候选基因中筛选出最稳定的内参基因。

目前，已经有关于一些物种内参基因的筛选的报道，如百合［12］、芹菜［13］、石蒜［14］、西瓜［15］、马铃薯［6］、龙眼［16］等。类似的内参基因的筛选在藻类中也有相关报道，如条斑紫菜［17］、坛紫菜［18］、赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）［19］、红色赤潮藻（Akashiwo sanguinea）［20］等。然而目前还没有用于蕨藻RT-qPCR分析的内参基因筛选的报道。

长茎葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）隶属于绿藻门（Chlorophyta）蕨藻属（Caulerpa），俗称“海葡萄”，是一种单细胞多核生物，但根据其形态学差异，可以分为3个部分，直立枝，匍匐茎和假根。海葡萄作为一种在热带地区广泛分布的大型经济绿藻，具有很高的经济价值和生态价值。首先其营养丰富，含有多种人体必需的氨基酸、维生素［21］、矿质元素和不饱和脂肪酸［22］，且脂肪含量低，是潜在的高营养价值保健食品，在日本和东南亚都被视为高级食材。同时长茎葡萄蕨藻还可以改善海洋环境，为海洋动物提供饵料以及良好的栖息环境对提高生物多样性和维护生态系统具有重大意义［23］。目前在中国的东南沿海城市已经开始了大规模的海葡萄养殖，但产量和品质参差不齐，其中不适宜盐度、温度、光照都会对长茎葡萄蕨藻的生长产生影响［24］。为了更深入的分析长茎葡萄蕨藻的抗逆分子机制，可以使用RT-qPCR来分析其在胁迫条件下的基因表达情况。选择合适的内参基因对得出准确可靠的RT-qPCR分析结果至关重要。

本研究使用RT-qPCR对长茎葡萄蕨藻5个候选内参基因：ClACT（肌动蛋白），ClGAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶），ClTUB（β微管蛋白），Cl18S（18S核糖体RNA）和ClEF1a（延伸因子1-alpha）在不同部位（匍匐茎和直立枝）和不同胁迫处理条件下表达水平进行了分析，并使用比较Ct值法，BestKeeper，geNorm和NormFinder软件对5个候选内参基因的稳定性进行了分析和比较。此外分别使用分析得出的最稳定和最不稳定的基因作为内参基因来对热激蛋白90（ClHSP90）和甾体传感结构域（ClSSD）的表达水平（已经明确这两个基因在胁迫条件下的表达情况）［25］进行校准来验证筛选结果的准确性。为分析长茎葡萄蕨藻甚至蕨藻在胁迫条件下抗逆机制提供了重要理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所使用的长茎葡萄蕨藻样品全部来自本实验室在海南省昌江长茎葡萄蕨藻养殖基地。挑选生长状态良好、藻体健壮的样品，使用无菌海水清洗几次后在光照培养箱中温度27℃，光照40 μmol/（s · m2）， 盐 度 30 ‰， 昼 夜 光 周 期 为12L∶12D暂养一周，然后进行处理。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 在洁净的1 L烧杯中分别加入800 mL无菌海水，向其中投放适量洁净藻体，分别置于光照培养箱中培养。处理方法如表1所示，每个处理设置3个生物学重复，处理4 h后，分别取其匍匐茎和直立枝用纸吸干表面水分，迅速放于液氮中，置于-80℃冰箱中储存。

表1 长茎葡萄蕨藻样品处理方法Table 1 Sample processing method of C. lentillifera

1.2.2 总RNA的提取与cDNA的合成 称取400-500 mg冷冻样品，放入液氮中充分研磨，使用OMEGA 公 司 的 E.Z.N.A.Plant RNA Kit（R6827-01）提取各个长茎葡萄蕨藻样品的总RNA，提取过程中使 用 OMEGA RNase-Free DNaseⅠ Set（E1091-01）处理消除基因组DNA污染。使用微量分光光度计（Nanodrop） 测量RNA 浓 度（ng/μL）、A260/280和A260/230。同时使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，来判断所提取的长茎葡萄蕨藻样品总RNA的总量和纯度。随后，使用Thermo公司的RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit（K1622），以所提取的长茎葡萄蕨藻样品总RNA为模板（2 μg）反转录成cDNA，使用已知基因引物进行PCR，再对其PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，放置于-20℃冰箱中储存。

1.2.3 候选内参基因的筛选与引物设计 以NCBI中已有的内参基因序列（如Actin、GAPDH、EF1a、TUB、18S等）为参考，利用本地BLAST搜索长茎葡萄蕨藻基因组（本实验室未发表数据）的同源序列，从比对结果中筛选出每个基因得分最高且E-value最低的序列，作为各内参基因的参考序列，分别命名为ClACT、Cl18S、ClGAPDH、ClEF1a和ClTUB。利用 PrimerPremier 5 软件设计基因特异引物，克隆验证各内参基因的序列后，再以验证无误的序列为模板，设计RT-qPCR引物。以cDNA为模板，通过检测普通PCR的扩增产物和分析产物的溶解曲线，检测各引物的特异性。经初步分析，5个候选内参基因（表2）满足RT-qPCR的实验要求，故用作后续研究。

表2 长茎葡萄蕨藻5个候选内参基因的RT-qPCR引物Table 2 RT-qPCR primers for five candidate internal reference genes of C. lentillifera

1.2.4 标准曲线的绘制及基因的扩增效率 通过绘制标准曲线来确定每对引物的扩增效率。将对照组样品的cDNA进行稀释（ClACT、ClGAPDH、ClEF1a、ClTUB进行5倍浓度稀释，Cl18S由于与其他基因相比表达丰度较高所以进行10倍浓度梯度稀释），各组样品均稀释5个浓度梯度。以不同稀释倍数的样品cDNA为模板，分别进行RT-qPCR，以Ct值为Y轴，起始模板浓度为X轴（log5，Cl18S为log10）绘制标准曲线，并计算引物扩增效率。计算公式如下：

1.2.5 候选内参基因RT-qPCR分析 分别以不同样品cDNA为模板，利用5对候选内参基因RT-qPCR引物进行扩增。使用TranStart Tip Green qPCR SuperMix（AQ141）配制RT-qPCR反应体系，每对引物的每个样品设置3个技术重复。

每个反应体系中含有2 μL的稀释cDNA模板和10 μL 的 2×TranStart Tip Green qPCR SuperMix， 上游和下游引物各1 μL，6 μL的无菌水，最终体积为20 μL。扩增条件如下：95℃预变性10 s；95℃变性10 s，50℃退火20 s，72℃延伸30 s，35个循环；然后从55℃缓慢升温至95℃进行溶解曲线分析。

1.2.6 数据分析 根据RT-qPCR的数据结果，使用EXCEL 2016和Origin 9.1比较各个样品的Ct值并绘制Ct值分布箱型图，再分别使用geNorm、NormFinder和BestKeeper 三个内参基因稳定性分析软件进行5个基因片段在胁迫条件下表达稳定性的分析。

1.2.7 内参基因可靠性验证 根据筛选结果，选择筛选出来的最优和最差的内参基因做为标准化因子，分别对不同环境胁迫下（光照胁迫360 μmol/（s·m2）；温 度 胁 迫 37℃ ；盐 度 胁 迫40‰）热激蛋白90（ClHSP90）和甾体传感结构域（ClSSD）基因的表达水平进行分析。表3为ClHSP90和ClSSD引物序列。

表3 ClHSP90 和 ClSSD 引物序列Table 3 Primer sequences of ClHSP90 and ClSSD

2 结果

2.1 RNA提取与质量检测

将提取出的总RNA样品使用微量分光光度计进行检测，结果显示：各样品的总RNA浓度较高，峰图优良，A260/280在2.0左右，A260/230大于2.0。用1%琼脂糖凝胶电泳检测（图1），结果显示：所提取的总RNA的28S和18S条带清晰明亮，没有其他杂带。以上结果均说明所提取的RNA的浓度和纯度较高，可以满足后续实验的要求。

图1 长茎葡萄蕨藻总RNA琼脂糖凝胶电泳检测Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from C. lentillifera

2.2 候选内参基因的引物特异性和PCR效率

使用对照组的cDNA为模板对所设计的候选内参基因和用于验证的差异表达基因引物进行普通PCR扩增后，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，条带单一，明亮，没有杂带和引物二聚体现象。使用不同的样品对各个候选内参基因和用于验证的差异表达基因进行RT-qPCR，将得到的熔解曲线汇总（图2），结果显示每个基因各个样品的溶解曲线峰值重合率较高，且只有单一的峰，在达到Tm值之前没有杂峰出现。进一步测序分析表明，所有测序扩增片段均与引物设计所用序列相匹配。各基因标准曲线相关性R2均大于99%，扩增效率均在90%-105%之间（表2）。

图2 长茎葡萄蕨藻5个候选内参基因和2个差异表达基因熔解曲线Fig. 2 Melting curve of 5 candidate internal parameters and two differential expression genes of C. lentillifera

2.3 候选内参基因的表达稳定性

如表4、5所示，本研究使用比较Ct值法、BestKeeper、geNorm、NormFinder软件分析了5个内参基因的表达稳定性，包括不同实验条件（温度胁迫、盐度胁迫和光照胁迫）以及不同组织部位（匍匐茎和直立枝）。BestKeeper可以计算出每个基因产生配对的相关系数（r）、标准偏差（SD）和变异系数（CV），标准偏差和变异系数越小，相关系数越大，内参基因的稳定性越好。NormFinder和geNorm程序都能最终获得各个内参基因的表达稳定值，表达稳定值越小，内参基因的稳定性越好。

表4 5个候选内参基因稳定性BestKeeper、geNorm和NormFinder分析结果Table 4 Analysis results of the stability of five candidate reference genes by BestKeeper, geNorm and NormFinder

使用LightCycler®96软件分析候选内参基因的Ct表达谱（图3）。Ct（阈值周期）值是扩增曲线和阈值线之间的交点，它是RT-qPCR反应中靶标浓度的相对量度。在本研究中，所有数据中候选内参基因的Ct值在7.28-27.30之间。在长茎葡萄蕨藻中，Cl18S的转录丰度最高（Cl18S在所有样品中的Ct值的算术平均值最小，为8.30，图3-F）；ClTUB在所有样本子集中的表达量均较低（ClTUB在所有样品中的Ct值的算术平均值最大，为24.94，图3-F）。Cl18S和ClACT基因的Ct值分布相对集中（7.28-10.99和19.53-23.53），因此Cl18S和ClACT的基因表达相对稳定。ClEF1a值的Ct分布较分散（19.92-26.22），因此与其他基因相比，ClEF1a的基因表达最不稳定。

图3 候选内参基因在样品中的表达谱Fig. 3 Expression profile of candidate internal reference genes in samples

通过计算每个候选内参基因4种分析结果（Ct值分布标准差，BestKeeper SD值，geNorm M值和NormFinder表达稳定值）的几何平均值对实验结果进行了整合，并对其进行了综合排序（表5）。当考虑所有样品时，ClACT的稳定性最好（SD=0.67，M=0.685，NormFinder稳定值=0.175）其次为Cl18S（SD=0.68，M=0.765，NormFinder稳 定 值 =0.352）。ClTUB稳定性最差（SD=0.86，M=1.077，NormFinder稳定值=0.706）。在长茎葡萄蕨藻的匍匐茎和直立枝中ClACT和Cl18S的稳定性都很高，ClTUB稳定性都较差，ClGAPDH在匍匐茎中表现出更好的稳定性。在光照胁迫条件下，ClGAPDH表达稳定性最好，ClTUB的稳定性较差。在盐度胁迫下ClACT和ClGAPDH则表现出更好的稳定性，ClEF1a的稳定性最差。在温度胁迫条件下ClGAPDH和Cl18S的稳定性较好，ClTUB的稳定性最差。综合以上结果，ClACT在大多样品中表达稳定性都较好，但会受到光照胁迫的影响，ClGAPDH在光照胁迫条件下稳定性最好，但在其他处理样本中稳定性存在差异。

表5 5个候选内参基因稳定性排序Table 5 Stability rankings of five candidate reference genes

使用geNorm来确定来内参基因的最佳数目。该软件可以分析引入一个新内参基因对标准化因子的配对变异系数（Vn/Vn+1）的影响，并根据Vn/Vn+1来确定在特定实验条件下最适内参基因数目。在我们的研究中，光照胁迫处理组的所有V值低均于0.15，其他处理组V值大多在0.15-0.25之间，多数实验组的V2/3值在0.15-2.00之间（图4）。

图4 geNorm软件确定最适内参基因数目Fig. 4 Number of the most suitable reference genes determined by geNorm software

2.4 筛选出的内参基因的验证

综合4种分析结果发现，ClACT，ClGAPDH和Cl18S在长茎葡萄蕨藻中的表达稳定性较好，但由于Cl18S在长茎葡萄蕨藻中的表达丰度与其他基因差异较大，不适宜作为内参基因使用。ClTUB在长茎葡萄蕨藻中大多处理样本中表达稳定性都较差。所以分别使用ClACT、ClGAPDH和ClTUB作为校准内参基因分析ClHSP90和ClSSD相对表达水平来验证所筛选出的内参基因的可靠性。结果表明，两个基因（ClHSP90和ClSSD）的表达水平在胁迫环境下均上调，并且当使用ClACT或ClGAPDH作为内参基因时，观察到相似的变化模式。但是，使用ClTUB（最不稳定）进行校准时，可以明显的观察到HSP90和SSD在光照胁迫下的表达水平被高估（图5），与实际情况不符。显然是由于样品中ClTUB表达的稳定性低引起的，这表明在RT-qPCR分析中选择合适的内参基因至关重要。

图5 使用不同内参基因分析HSP90（A）和SSD（B）在长茎葡萄蕨藻胁迫条件下的相对表达量Fig. 5 Analysis of relative expressions of HSP90（A）and SSD（B）by different reference genes under the stress of C. lentillifera

3 讨论

实时荧光定量PCR的灵敏性高、重复性好、特异性强，已经成为研究基因表达的重要方法之一。为了获得更准确的数据和结果，实验中的每一步都需要做好，包括RNA的质量，引物设计，实验操作等，但除了这些，选择合适的内参基因也是必不可少的步骤。理想的内参基因应该具备以下几个条件：（1）同种生物的不同组织部位不同生长阶段都能稳定表达［26］；（2）在各种环境下都能稳定表达，不受各种生物和非生物胁迫影响［27］；（3）在实验材料中不存在假基因；（4）表达丰度与目标基因相近［28］。

由于不同的分析方法的侧重点不同，所以给出的内参基因稳定性排序结果也不同。例如在拟南芥中Actin和EF1a基因在geNorm分析结果中为最稳定的两个基因，而这两个基因在NormFinder分析结果中的排名却相对靠后［29］。在本研究中也发现，ClGAPDH的稳定性在不同的分析方法之间差异很大。因此，为了获得更准确的结果，最好使用不同的软件进行综合分析。在某些物种中，相同内参基因在不同组织部位中的稳定性可能有所不同。EF1a基因在胁迫条件下的大叶龙胆叶片中表达较稳定，但在根或不同发育阶段的组织中表达不稳定［30］。但在我们的研究中，通过比较长茎葡萄蕨藻不同部位的候选内参基因的排序结果发现，其直立枝和匍匐茎各个基因的排列顺序虽有差别，但筛选出的最佳内参基因都为ClACT，而ClTUB基因的稳定性都较差。这可能与长茎葡萄蕨藻作为单细胞多核生物的形态特征有关。同时我们发现光照胁迫条件下长茎葡萄蕨藻内参基因稳定性排序与其他样品之间存在一定差异，这可能与长茎葡萄蕨藻在光照胁迫条件下的应激调控机制有关，但由于长茎葡萄蕨藻对光照胁迫的调控机制尚未明确，具体原因还需要进一步研究才能确认。

Actin即肌动蛋白基因，是细胞中的一种重要的骨架蛋白，并且同时在细胞移动，细胞分泌，细胞吞噬等起到重要作用，在不同物种间表现出高度的保守性。在研究条斑紫菜叶状体在不同环境胁迫下的基因表达情况时，可以选择肌动蛋白Actin作为内参基因［31］。本研究发现长茎葡萄蕨藻中ClACT表达最稳定，最适合作为研究胁迫条件下长茎葡萄蕨藻基因表达情况时的内参基因。在使用RT-qPCR研究莱茵衣藻，猕猴桃和龙眼的基因表达情况时，也通常使用Actin作为内参基因［32-34］。GAPDH即甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，是糖酵解反应中的一个酶，广泛分布于各种组织中的细胞，并且几乎在所有组织中都有较高水平的表达，同种生物的不同组织的表达水平也几乎一致。已经有研究证明GAPDH在衣藻中表达最稳定，最适合作为内参基因［35］。本研究中ClGAPDH的表达稳定性与其他候选基因相比处于较高水平，可以作为内参基因。同时，在其他物种如李子［36］，枸杞［37］等中也发现了同样的结果。

研究中Cl18S在长茎葡萄蕨藻中的表达丰度较高，与其他基因表达丰度差异很大，不适宜做为优先考虑的内参基因。在其他的物种的研究中也发现了相同的结论，如18SrRNA在对龙眼［16］和马铃薯［6］等进行内参基因的筛选时，18SrRNA也都显示出较高的表达丰度。Tubulin在进化中具有高度的保守性，所以常在RT-qPCR中被用做内参基因。例如Tubulin在坛紫菜不同生长阶段表达稳定，丰度适合，可作为内参基因［18］。但本研究中ClTUB在长茎葡萄蕨藻不同组织部位中、光照胁迫条件下和温度胁迫条件下的表达稳定性都相对较差，所以并不适合作为长茎葡萄蕨藻的内参基因。

geNorm软件计算得出的V值可以用于确定最佳内参基因数，通常将0.15用作临界值，这意味着当Vn/Vn+1小于0.15时，不需要额外增加内参基因。但是，实际上0.15作为临界值过于理想化，在大多数研究中都很难达到［9］，因此可以根据实验结果对其进行微调。基于此标准，建议使用两个筛选出的最稳定基因作为内参基因来对胁迫条件下长茎葡萄蕨藻基因表达情况进行校准。

4 结论

本研究分析和比较了5个候选内参基因长茎葡萄蕨藻不同胁迫条件和不同组织部位的表达稳定性，结果显示使用两个合适的内参基因进行RT-qPCR标准化，可在长茎葡萄蕨藻基因表达情况研究中获得更为准确的结果。在所有测试的实验条件下，ClACT和ClGAPDH的组合都是最佳内参基因组合，而ClTUB表达稳定性较差不适合作为内参基因。ClHSP90和ClSSD基因表达验证表明，选择合适的内参基因对于在RT-qPCR中获得准确的结果至关重要。本研究为使用RT-qPCR分析胁迫条件下长茎葡萄蕨藻基因表达提供了理论支持。