烟台黑猪SLA-2基因真核表达载体的构建及表达

胡晓 王宝宝 窦少华 姜南 付常振 金行 高凤山

（大连大学生命科学与技术学院，大连 116622）

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是染色体上由高度多态、紧密连锁的基因座组成的一个遗传区域，编码一系列与免疫应答相关的分子。猪的MHC也叫猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA）。SLA由 3个 基因簇组成，分别是SLA I、II、III。其中SLA I类分子主要介导细胞免疫应答。该分子包括重链和轻链［1］，轻链只有一个等位基因β2微球蛋白（β2 microglobulin，β2m）；重链具有多态性，包括胞内区、跨膜区、胞外区和信号肽4个区域，含有SLA-1、SLA-2和SLA-3三个功能基因［2-3］。其中，SLA-2比SLA-1和SLA-3在信号肽的起始端多3个氨基酸。重链与轻链以非共价键结合构成SLA I类分子，不仅识别内源性抗原肽［4］，也可以通过交叉递呈途径识别外源性抗原肽［5］。被识别的多肽与SLA I类分子形成抗原肽-MHC分子复合物（peptide-MHC complex，pMHC）并被递呈到细胞表面，pMHC进一步与CD8+T淋巴细胞表面的T细胞受体（T cell receptor，TCR）结合，激活CD8+T淋巴细胞，使活化的CD8+T淋巴细胞转化为有细胞毒性的T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），发挥毒性作用并对靶细胞造成杀伤，启动机体的细胞免疫应答［6］。不同的SLA I类分子递呈的抗原肽不同，根据抗原递呈机理，可建立不同SLA I类分子表位递呈规律的研究平台。

烟台黑猪是我国优良的地方猪种之一，基因资源十分宝贵［7-8］。本课题组已经克隆了烟台黑猪SLA-2基因，并构建了该基因的原核表达载体，进行了原核表达研究［9］。然而，烟台黑猪SLA-2基因的真核表达研究尚未开展，其表位递呈规律研究平台也尚未建立。本研究拟以烟台黑猪SLA-2-YT/pMD 18-T全基因为材料，构建SLA-2-YT编码区基因的真核表达载体，并使其在sT2细胞系中优势表达，为探究烟台黑猪SLA-2-YT基因的抗原表位递呈规律等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体和细胞 烟台黑猪SLA-2-YT/pMD18-T菌种、psPAX2菌种、pMD2.G菌种由本实验室保存；pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro（简称pCDH）真核表达载体菌种购自中国上海思享生物科技有限公司；pMD 19-T Simple Vector和Escherichia coli.Top10菌种购自宝生物工程（大连）有限公司；Stbl 3感受态细胞购自北京全式金生物科技有限公司；人胚胎肾上皮细胞（HEK-293T）由大连医科大学李文哲教授课题组惠赠；猪肾上皮细胞（PK15）购自中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心并由本实验室保存；sT2细胞由本实验室在前期工作中利用CRISPR/Cas9技术将PK15细胞的Tap转运蛋白基因（TAP1、TAP2）敲除后获得并保存。

1.1.2 主要试剂 质粒DNA小量抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒及配制LB培养基的试剂均购自上海生工生物工程有限公司；高保真DNA聚合酶、核酸染料、Lipoectine2000脂质体转染试剂购自诺唯赞有限公司 ；T4 DNA Ligase、DL 2000 DNA Marker、dNTP、限制性内切酶（EcoR I、Hind III、Xba I、Not I）购自宝生物工程（大连）有限公司；无内毒素质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清购自BI公司；DMEM高糖培养基和Opti-MEM培养基购自 Gibco公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自宝生物（大连）有限公司；Western Blotting使用的0.45 μmPVDF膜购自Millipore公司；小鼠SLA-1-HB01单克隆抗体由本实验室自制；GAPDH Mouse Monoclonal antibody（ 货 号 ：60004-1-Ig） 购自Proteintech公司；Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（货号：D110087）购自上海生工生物工程有限公司；超敏ECL化学发光试剂盒购自新赛美生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 梯度PCR仪购自基因有限公司；各型电泳仪和紫外分析仪购自北京市六一仪器厂；二级生物安全柜和二氧化碳培养箱购自ESCO公司；超灵敏多功能凝胶成像仪购自通用电气公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank数据库中烟台黑猪SLA-2-YT编码区（coding sequence，CDS）基因序列（GenBank序列号：AB672508.1），遵守引物设计原则，使用Vector NTI 11.5和Oligo 7软件，设计1对扩增烟台黑猪SLA-2基因编码区序列的特异性正、反向寡核苷酸引物（上下游引物），根据pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体的序列和结构特点，选择的限制性内切酶为：Xba I和 Not I，在上下游引物的5′端分别添加酶切位点和保护性碱基，引物信息见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCR引物信息Table 1 Information of the primers used in PCR

1.2.2 目的基因PCR扩增与DNA片段回收 以SLA-2-YT/pMD18-T质粒为模板，以pSLA-2-YTF/pSLA-2-YT-R 作 引 物， 用 Phanta®Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶系统进行PCR，扩增SLA-2-YT编码区基因序列，PCR反应体系为：5×SF buffer（with 10 mmol/L MgSO4），5 μL ；dNTP Mix（10 mmol/L each），1 μL；SLA-2-YT/pMD 18-T 全 基 因质粒（提取后稀释30倍），4 μL；SLA-2-YT-F（25 μmol/L），1 μL ；SLA-2-YT-R（25 μmol/L），1 μL ；Phanta®Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U/μL），0.5 μL；超纯水补足至25 μL；PCR扩增程序为：95℃，预变性3 min；95℃变性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪成像。确认目的条带大小正确后，用DNA 凝胶回收试剂盒进行胶回收。由于用DNA聚合酶Phanta®Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增的目的片段末端平滑化不易与pMD 19-T Simple Vector连接，因此需要在回收后的PCR产物DNA双链的3′端分别添加Poly A尾（碱基“A”），使其转变为黏性末端，反应液体系如下：10×Ex Taq buffer，5 μL ；dATP（10 mmol/L），1 μL ；PCR 回 收产物，35 μL ；Ex Taq 酶（5 U/μL），1 μL，超纯水补足至50 μL；条件为：72℃水浴15 min。添加Poly A尾后的PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统成像，目的条带用DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收并保存回收产物。

1.2.3 SLA-2-YT编码区基因TA克隆载体的构建 将回收的目的条带与pMD19-T Simple Vector连接，反应体系为：pMD 19-T Simple Vector，0.5 μL；加Poly A尾回收产物，9.5 μL；Solution I，10 μL；条件为：16℃低温水浴2 h。将连接产物转化至Escherichia coli. Top10感受态细胞，涂平板，37℃过夜培养，挑取生长良好的重组单克隆菌落扩大培养后进行质粒提取，将提取的重组质粒用Not I/Xba I进行双酶切验证，选择初步鉴定正确的阳性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司测序。通过双向DNA测序确认插入序列的完整性后，将测序正确的阳性克隆菌株命名为 SLA-2-YT/pMD 19-T Simple，并保存菌种供后期实验使用。

1.2.4 SLA-2-YT编码区基因真核表达载体的构建 从超低温冰箱取出SLA-2-YT/pMD 19-T Simple和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro菌种，经平板划线、挑取单菌落培养过后，用DNA质粒小提中量试剂盒提取质粒，并用琼脂糖凝胶电泳检测。对SLA-2-YT/pMD 19-T Simple质粒进行Not I/Xba I双酶切处理，回收目的条带；对真核表达载体pCDH-CMV-MCSEF1-Puro质粒（环状）同样进行Not I/Xba I双酶切处理，使载体线性化，并回收载体条带。将目的条带与载体条带用T4 DNA连接酶连接，反应体系为：目的条带 15 μL（μg）；载体条带 0.5 μL（μg）；超纯水1.5 μL；条件为：45℃水浴5 min，立即冰浴2 min，然后向反应液中加入10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL ；T4 DNA Ligase 1 μL ；混匀后在 16℃低温水浴锅中过夜放置。连接产物转化至Stbl 3感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素（AMP+）的LB平板上，37℃过夜培养；然后挑取单菌落至AMP+LB液体培养基中，37℃振荡培养12 h；培养的菌液提取质粒后利用双酶切鉴定真核重组DNA载体中是否携带插入片段；将初步鉴定正确的阳性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司测序，使用Vector NTI 11.5对DNA测序结果进行序列分析验证插入核苷酸序列的正确性。将测序正确的阳性重组菌株命名为SLA-2-YT/pCDH，重组质粒SLA-2-YT/pCDH图谱见图1。

图1 SLA-2-YT/pCDH 重组表达质粒示意图Fig. 1 Schematic diagram of the recombinant expression plasmid SLA-2-YT/pCDH

1.2.5 嘌呤霉素终浓度测定 复苏的sT2细胞传代两次待细胞状态稳定后，以每孔4×105个细胞铺24孔板，共铺33个孔，37℃ CO2培养箱中培养至细胞融合率达到70%-80%时，每孔添加终浓度为0、5、10、15、30、60、90、200、300、500、1 000 μg/mL的嘌呤霉素，并将培养基补足至2 mL，每个浓度设置3个重复，每2 d使用含有对应浓度的嘌呤霉素的培养基对细胞进行换液，7 d后可以杀死所有细胞的最低浓度即为筛选转染外源基因的sT2细胞的最佳嘌呤霉素终浓度。

1.2.6 慢病毒包装 将冻存的HEK-293T细胞复苏，传代两次待细胞状态稳定后进行慢病毒包装前的细胞铺板，每个60 mm培养皿接种1.5×106个细胞，待培养皿中的HEK-293T细胞融合率达到80%-90%后，按照Lipoectine2000脂质体转染试剂的说明书将pCDH-CMV-MCS-EF1-Pruo质粒和SLA-2-YT/pCDH重组质粒分别转染到HEK-293T细胞中，置37℃CO2培养箱中培养6 h，去除培养皿中含转染试剂的培养基，更换为4 mL新鲜的DMEM培养基，分别于更换培养基后48 h、72 h收集培养皿中的上清液，经3 000 r/min离心10 min、0.22 μm PVDF膜滤器过滤，根据文献测定并计算病毒滴度［10］，将剩余的病毒液冻存于超低温冰箱中，备用。

1.2.7 慢病毒感染sT2细胞及抗性筛选 根据文献及最佳感染复数（multiple of infection，MOI）值计算公式：MOI值=病毒滴度（TU/mL）×病毒体积（mL）/细胞个数，设定MOI值梯度为2.5、5、10、20、40、60，分别进行病毒感染预实验，确定感染sT2细胞的最佳MOI值范围［11］。将冻存的sT2细胞复苏，传代2次后进行慢病毒感染前的细胞铺板，状态良好的细胞以每孔1.5×105个细胞接种于6孔板中，37℃ CO2培养箱中培养12 h至细胞完全贴壁，从超低温冰箱取出1.2.6中收集的病毒液于4℃解冻备用，参考最佳MOI值，将1.5 mL病毒液与0.5 mL DMEM培养基混匀后加入需感染的孔板中，同时在其中一个孔板中只加入2 mL DMEM培养基，作为对照组，37℃ CO2培养箱中培养；病毒感染24 h后去除含病毒的培养基，更换为新鲜的DMEM培养基，继续在37℃ CO2培养箱中培养；换液6-8 h后，加入终浓度为30 μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，待6孔板中细胞长满后传代至100 mm细胞培养皿中继续培养至细胞长满，一部分细胞进行Western Blotting验证，另一部分细胞添加嘌呤霉素继续筛选，直到获得成功转染外源基因的单克隆细胞，扩大培养并命名为pCDH/sT2、SLA-2-YT-pCDH/sT2，将部分细胞冻存于液氮罐中，备用。

1.2.8 Western Blotting检测外源基因的表达 复苏PK15、sT2两个细胞株，传代两次待细胞状态稳定，使用RIPA细胞裂解液分别提取PK15、sT2和1.2.7中筛选得到的pCDH/sT2、SLA-2-YT-pCDH/sT2细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，然后将蛋白原液、超纯水和5×蛋白上样缓冲液按比例混匀后煮沸5-10 min，制成终浓度为30 μg/μL的蛋白溶液样品，分别取10 μL样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后参考预染Marker进行切胶并将蛋白转印到PVDF膜上，转膜结束后，使用1×丽春红染液染色，确认转膜成功后参考预染Marker切割目的条带和内参GAPDH条带，用5%BSA溶液在室温下封闭1 h，除去封闭液后，含目的条带的膜中加入稀释的小鼠抗SLA-1-HB01单克隆抗体（视抗体推荐倍数稀释），含GAPDH条带的膜加入稀释的小鼠抗GAPDH 单克隆抗体，室温孵育1 h，再4℃孵育过夜，去除抗体溶液，用1×TBST溶液洗膜4次，每次5 min，彻底洗去未与蛋白结合的一抗，分别加入稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1 h，然后用1×TBST洗膜4次，每次5 min，最后采用超敏ECL化学发光试剂盒进行显色，通过GE AI600多功能超灵敏成像仪进行显影成像，以检测sT2细胞中SLA-2-YT的表达量。

1.2.9 统计学处理 采用Image J 软件分析Western Blotting杂交条带的累积光密度值（IOD），计算目的蛋白的相对光密度值（目的条带的IOD值与内参GAPDH的IOD值之比），然后采用GraphPad Prism 8.0.1软件对数据进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 烟台黑猪SLA-2-YT CDS区基因PCR扩增及加尾

对烟台黑猪SLA-2-YT基因编码区进行PCR扩增，结果显示扩增的目的基因条带大小约为1 100 bp（图2-A），与理论设计值1 104 bp相符，表明目的基因被成功扩增。PCR回收产物加Poly A尾并回收，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在同样条件下加尾回收产物略大于PCR回收产物（图2-B），初步判断加Poly A尾成功，可以用于下一步实验。

图2 烟台黑猪SLA-2-YT基因CDS区PCR扩增与加尾Fig. 2 PCR amplification and tailing of SLA-2-YT gene CDS region in Yantai black pig

2.2 SLA-2-YT/pMD 19-T Simple克隆表达载体鉴定

2.2.1 重组质粒SLA-2-YT/pMD 19-T Simple限制性双酶切鉴定 利用Xba I、Not I限制性内切酶对SLA-2-YT/pMD 19-T Simple质粒进行双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测，根据结果（图3）可以看出：每个样品的泳道上均有两个条带，靠近点样孔端的条带为载体带，大小约为2 692 bp，离点样孔较远的条带为目的条带，大小约为1 100 bp，1-7号样品的载体条带大小正确，即1-7号样品可能为成功构建的克隆质粒，将对应的3个菌株送去生物公司测序，测序结果经分析后显示1、2号菌株的序列正确，即1、2号为成功构建的重组克隆菌株。

2.2.2 序列分析 SLA-2-YT/pMD 19-T Simple经核酸序列测序后，进一步用Vector NTI 11.5进行序列比对，结果（图4）显示SLA-2-YT/pMD 19-T Simple重组克隆载体中插入的SLA-2-YT编码区基因序列与原序列100%同源，未出现核苷酸突变。

图4 Vector NTI 11.5分析SLA-2-YT/pMD 19-T Simple重组克隆载体中插入序列Fig. 4 Insertion sequences in SLA-2-YT/pMD 19-T Simple recombinant vector analyzed by Vector NTI 11.5

2.3 SLA-2-YT/pCDH真核表达载体鉴定

2.3.1 重组质粒SLA-2-YT/pCDH限制性双酶切鉴定 真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒首先经限制性内切酶Xba I、Not I双酶切后进行胶回收，0.8%琼脂糖凝胶电泳结果（图5）显示回收的条带大小约为7 300 bp，与理论值7 384 bp相符，表明载体回收成功。SLA-2-YT/pMD 19-T Simple质粒经双酶切并回收目的基因后，与真核表达载体在T4 DNA Ligase的作用下连接，导入Stbl 3感受态细胞经转化、挑取单菌落扩大培养后，再次进行双酶切鉴定，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图6）显示：每个样品的泳道上均有两个条带，靠近点样孔端的条带为载体带，大小约为7 384 bp，离点样孔较远的条带为目的条带，大小约为1 100 bp，1-3号样品的载体条带和目的条带的大小正确。

图5 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro 载体回收Fig. 5 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro vector recovery

图6 重组质粒SLA-2-YT/pCDH双酶切鉴定Fig. 6 Identification of recombinant plasmid SLA-2-YT/pCDH by double digestion

2.3.2 序列分析 为进一步确定目的基因与真核表达载体连接成功与否，将图6对应的3个菌株送去生物公司测序，测序结果经初步分析后显示2、3号菌株的序列正确，表明基因插入成功，即2、3号为成功构建的重组真核表达菌株。进一步经Vector NTI 11.5进行序列比对，证实SLA-2-YT/pCDH重组真核表达载体中插入的SLA-2-YT编码区基因序列与原序列的同源性仍为100%，没有出现核苷酸突变，能够正确编码对应的蛋白。

2.4 嘌呤霉素最佳浓度筛选

通过不同浓度的嘌呤霉素作用于未转染的sT2细胞，168 h后对存活细胞使用血球计数板计数。结果（图7）显示：不加嘌呤霉素的孔板内的细胞正常增殖，由于孔板底面积有限，细胞增殖数目受到限制；而添加了嘌呤霉素的孔板中的细胞增殖在不同程度上被抑制。由于嘌呤霉素的浓度不断增大，各孔板中的细胞出现了不同程度的死亡现象：当嘌呤霉素的浓度达到500 μg/mL对应孔板中细胞无存活，根据惯例，选择最低致死浓度的前一个浓度300 μg/mL进行筛选。因此，选择300 μg/mL作为嘌呤霉素最佳筛选浓度。

图7 嘌呤霉素作用于sT2细胞的致死浓度曲线Fig. 7 Lethal concentration curve of puromycin on sT2 cells

2.5 HEK-293T细胞慢病毒包装及感染sT2细胞

将携带SLA-2-YT的质粒和两种包装质粒共同转染HEK-293T细胞后，成功包装出慢病毒质粒。通过不同浓度的病毒液感染HEK-293T细胞，测得病毒滴度约为1×105TU/mL，通过设定MOI值梯度，用1.2.6中获得的慢病毒进行感染，通过显微镜每天多次观察细胞状态，确定慢病毒的最佳感染sT2细胞复数为20。另外，本研究涉及的猪肾上皮细胞（PK15细胞）、用于慢病毒感染的sT2细胞（TAP基因敲除的PK15细胞），导入空载体pCDHCMV-MCS-EF1-Puro质粒的sT2细胞，导入SLA-2-YT/pCDH重组质粒的sT2细胞在光学显微镜下的形态如图8所示，可见这些细胞生长状态良好、相互之间的外观形态无明显区别。

图8 光学显微镜下观察慢病毒感染后的细胞状态Fig. 8 Observation of cell state after lentivirus infection under light microscope

2.6 Western Blotting检测SLA-2-YT/pCDH表达

以PK15细胞系为阳性对照，转染空载体pCDH的sT2细胞为阴性对照，未转染SLA-2-YT/pCDH质粒的sT2细胞系为空白对照，通过Western Blotting实验检测SLA-2-YT/pCDH的表达情况。结果（图9）表明，筛选出的4株细胞，与sT2、pCDH/sT2相比较，3号细胞株的SLA-2-YT基因得到了高丰度表达，大小约为45 kD，与理论值相符。用Image J软件分析累积光密度值后计算目的蛋白的相对表达量，用GraphPad Prism 8.0.1作图并通过计算得出SLA-2-YT-pCDH/sT2 3号细胞株与sT2细胞、pCDH/sT2细胞相比较，SLA-2-YT呈优势表达，且相对表达量之间差异极显著（P＜0.01）。表明插入载体的SLA-2-YT已在sT2细胞中成功表达，且表达量较高。

图9 Western Blotting 检测 SLA-2-YT/pCDH 在 sT2 细胞中的表达Fig. 9 Western Blotting to detect the expression of SLA-2-YT/pCDH in sT2 cells

3 讨论

本研究在构建真核表达载体时选择的pCDHCMV-MCS-EF1-Puro载体是慢病毒载体系统，其载体序列上有多个限制性内切酶位点，可在PCR引物上添加酶切位点利于目的基因与真核表达载体连接；它具有氨苄青霉素抗性，筛选标记为嘌呤霉素，便于前期单克隆菌株的扩大培养和质粒转染后的细胞筛选［12］；本研究将Stbl 3菌株作为真核表达载体的宿主菌，它是慢病毒载体系统优良的宿主菌株，其基因组中含有重组酶recA13突变，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率［13］。本研究用于转染的细胞是实验室前期利用基因编辑技术将PK15细胞的TAP转运蛋白基因（TAP1、TAP2）敲除后得到的sT2细胞，该细胞中需TAP转运蛋白参与递呈内源性抗原的胞质途径被阻断，因此只能递呈外源性的抗原肽，从而可以通过有目的设计外源性抗原肽筛选细胞递呈的SLA I限制性的抗原表位。但研究中发现，将TAP1和TAP2基因敲除后，PK15细胞本身表达的SLA I类分子急剧减少，甚至不表达，从而为引入外源SLA I分子在sT2表达创造了条件，从而可以建立表达特定SLA I类分子的sT2细胞系，将来可以筛选特定SLA I类分子限制性的CTL表位。在开展本实验时，慢病毒包装并感染sT2细胞后的嘌呤霉素筛选过程并不顺利，由于初次筛选时选择的嘌呤霉素浓度不合理，SLA-2-YT在sT2细胞内的表达量不够高。在设置合理的嘌呤霉素浓度梯度对sT2的嘌呤霉素最佳筛选浓度进行确定后，选择能够杀死大部分sT2细胞的浓度（300 μg/mL），最终得到了优势达外源SLA-2-YT基因的sT2细胞。

烟台黑猪是我国地方特色品种，研究我国地方品系猪SLA I类分子基因的表达及相关功能更具有战略意义［9，14］。本研究不仅成功构建了烟台黑猪SLA-2-YT基因的真核表达载体，并且实现了在 sT2细胞的优势表达，从而建立了烟台黑猪SLA-2-YT基因在sT2细胞中的抗原递呈研究体系。课题组在后续研究中将进行SLA-2-YT限制性的CTL多肽表位筛选，并进行相关功能研究。

4 结论

本实验成功构建了SLA-2-YT/pCDH重组真核表达载体，并成功转染至sT2细胞，使其在sT2细胞中优势表达，为研究外源SLA-2-YT在sT2细胞中的抗原递呈规律及CTL多肽表位筛选奠定了基础。