青稞HVUL1H 08544.2 基因特性分析及互作蛋白筛选

旺 姆，羊海珍

（省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室/ 西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏 拉萨 850032）

青稞（Hordeum vulgareL. var. nudum Hook. f）营养价值丰富，是青藏高原藏族人民的主要粮食，同时也是重要的畜牧饲料以及啤酒、保健食品的原材料［1］。青稞作为西藏种植面积最大、产量占全区粮食作物总产比重最高的农作物，在西藏的农业发展中一直占据举足轻重的地位［2］。然而，青稞在生长过程中易遭受各种病原菌的侵染，导致产量和品质下降。其中由布氏白粉菌属大麦专化型活体寄生菌（Blumeria graminis f.sp.hordei）引起的真菌病害，在西藏各个青稞种植区普遍发生，危害日趋严重［3-4］。

目前，西藏青稞白粉病的基础研究薄弱，主要集中在抗病鉴定、防治技术研究等方面［5-7］，有关青稞白粉病抗病机制的研究报道较少。发掘抗白粉病基因，解析青稞白粉病抗性机制，可以为青稞抗病育种提供指导，对防治青稞白粉病、保障青稞粮食安全具有重要意义。试验前期进行了青稞应答白粉菌侵染的转录组学研究［8］，从分析结果中筛选到一个受白粉菌诱导后表达量显著上调的基因HVUL1H08544.2，推测该基因在青稞抵御白受粉病侵染的过程中可能扮演着重要作用。本研究以HVUL1H08544.2为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术在青稞白粉菌诱导的cDNA 文库中筛选互作蛋白，为进一步揭示HVUL1H08544.2 应答白粉菌侵染的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

青稞品种“藏青13”、青稞白粉菌诱导酵母双杂交cDNA 文库、大肠杆菌DH5α 菌株均由本实验室保存；pGBKT7 载体、pGADT7 载体、SD 营养缺陷型培养基、YPDA 培养基、限制性内切酶、高保真扩增酶均购自大连宝生物工程有限公司；Y2HGold 酵母感受态细胞购自于上海唯地生物技术有限公司；RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA 纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购于无锡百泰克生物技术有限公司；一步法克隆试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司；其余常规生化试剂购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 HVUL1H08544.2基因的克隆及序列分析

采集生长10 d的青稞叶片样品，参照试剂盒说明书，提取青稞总RNA，反转录为cDNA。根据HVUL1H08544.2 基因的序列和pGBKT7 载体图谱，设计并合成带有载体同源系列的基因特异性引物HVUL1H08544.2-F （5’ -GCCATGGAGGCCGAATTCATGGAGTCCGACATGGACATG-3’） 和HVUL1H08544.2-R （5’ -CTGCAGGTCGACGGATCCTCAGTGGGCTTCTTCTCGCAT-3’）；以青稞叶片的cDNA 为模板，使用高保真酶进行PCR 扩增，将有目的条带的PCR产物回收纯化后送上海生工生物工程公司测序。所获基因序列利用Expasy（https：//web. expasy. org/cgi-bin/protparam/）分析 蛋白质序列的分子量和等电点；用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白的结构域；利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST工具进行同源基因序列比对。

1.3 诱饵载体构建

参照一步法克隆试剂盒说明书，将测序验证正确的目标片段连接到经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切的pGBKT7 载体上，采用热激法转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB 平板上，37 ℃过夜培养。挑取单菌落，使用pGBKT7 载体 的 通用引物BD-F（5’- CGACATCATCATCGGAAGAGAGTAGT-3’） 和 BD-R （5’ -CCGGAATTAGCTTGGCTGCAA-3’）进行PCR 检测，将检测获得的阳性克隆进行扩大培养后提取质粒，送公司测序确认。

1.4 诱饵载体自激活活性检测

参照MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System 操作手册，采用聚乙二醇/醋酸锂的方法，将重组诱饵载体pGBKT7-HVUL1H08544.2 和pGADT7空载体共转入Y2HGold酵母感受态中，转化液稀释10 倍后涂布于SD/-Trp-Leu 和SD/-Trp-Leu-His-Ade营养缺陷型固体培养基上，30 ℃倒置培养3～5 d，观察其生长情况。

1.5 诱饵蛋白与青稞cDNA文库杂交

将重组诱饵载体pGBKT7-HVUL1H08544.2 转入Y2HGold 酵母感受态中，在SD-Trp 平板上培养3 d。挑取单菌落接种于50 mL SD-Trp 液体培养基中，30 ℃，220 rpm 培养至OD600为0.8 后离心，用5 mL SD/-Trp 重悬沉淀并转移至2 L 锥形瓶中，加入2 mL 青稞白粉菌诱导的cDNA 文库菌液（Y187）和45 mL 2×YPDA 液体培养基，30 ℃，40 rpm 培养20～24 h，取1滴菌液于显微镜下观察是否出现酵母合子细胞；离心收集菌体，用50 mL 0.5×YPDA 液体培养基重悬后离心，弃上清液，用10 mL 0.9% NaCl溶液重悬菌液，分别涂布300 μL 至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基平板上，30 ℃培养3～5 d，挑取酵母单克隆转到另一个SD/-Trp-Leu-His-Ade 培养基上复筛，重复3次，得到候选克隆子。

1.6 阳性克隆鉴定及分析

使用pGADT7 载体通用引物AD-F（5’-GGAGTACCCATACGACGTACC-3’）和AD-R（5’-TATCTACGATTCATCTGCAGC-3’）对3 次转板后仍能正常生长的酵母单克隆进行PCR 检测，回收PCR 扩增条带后送公司测序。将测序所得序列比对到青稞基因组数据库，得到与HVUL1H08544.2相互作用的蛋白，利用Uniprot（https：//www.uniprot.org）对互作蛋白进行gene ontology（GO）注释。

2 结果与分析

2.1 HVUL1H08544.2基因的克隆及特性分析

以青稞叶片的cDNA 为模板，PCR 扩增到上下游分别带有17 bp 和18 bp 载体同源序列的目的片段（711 bp），条带大小约750 bp（图1），符合预期大小。通过Expasy分析可知，HVUL1H08544.2编码的蛋白包含236个氨基酸，相对分子量为58.26 kD，理论等电点为5.08。 结构域分析显示，HVUL1H08544.2 包含一个保守的HLH 结构域，位于67 和116 氨基酸之间，属于bHLH 转录因子家族成员。BLAST 结果表明，在其他物种中，山羊草（Aegilops tauschii）中 的bHLH35-like 基 因 与HVUL1H08544.2系列一致性最高，为88.24%。

图1 HVUL1H08544.2基因的电泳检测

已有研究表明，bHLH 转录因子不仅能调控植物的生长发育、信号转导及合成代谢等，而且参与了植物低温、干旱、高盐、缺铁等逆境胁迫响应过程［9］。近年来陆续有研究表明，bHLH 转录因子在植物应答病原菌侵染的过程中也发挥了重要作用［10-11］。本研究中，受白粉菌诱导后上调表达的HVUL1H08544.2 属于bHLH 转录因子，与上述研究结果相符。

2.2 诱饵载体的构建和自激活活性检测

将HVUL1H08544.2 基因片段与pGBKT7 载体进行同源重组后转化大肠杆菌，随机挑取6 个单菌落进行PCR 鉴定，发现所有菌落均有目的条带（图2）。经过比对，质粒测序结果与HVUL1H08544.2序列完全一致，表明重组诱饵载体pGBKT7-HVUL1H08544.2 构建成功。将诱饵载体pGBKT7-HVUL1H08544.2 与pGADT7 空载体共转化酵母Y2HGlod，在SD/-Trp-Leu 培养基平板上有正常的菌落生长（图3A），说明pGBKT7-HVUL1H08544.2能够在酵母中成功表达；在SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基平板上没有菌落生长（图3B），说明诱饵载体不能启动下游报告基因His，Ade 的表达，没有转录自激活活性。

图2 重组诱饵载体pBGKT7-HVUL1H08544.2的PCR鉴定

图3 共转化pGBKT7-HVUL1H08544.2与pGADT7的菌株在缺陷培养基上的生长情况

2.3 HVUL1H08544.2互作蛋白的筛选

将含有pGBKT7-HVUL1H08544.2 诱饵载体的Y2HGold 菌株与含有青稞cDNA 文库的Y187 菌株共培养，22 h后镜检可观察到三叶草型的酵母合子细胞（图4），表明诱饵菌株与文库菌株形成了结合子，杂交成功。经过SD/-Trp-Leu-His-Ade 缺陷培养基的3次筛选，共获得32个候选单克隆。PCR 鉴定结果显示能扩增出条带的单克隆有26 个，片段大小在500 bp和2000 bp 之间（图5）。将PCR条带测序结果在青稞基因组数据库中进行比对，去除重复克隆，排除没有完整开放阅读框的蛋白后，进行GO 注释，最终得到5 个与pGBKT7-HVUL1H08544.2 相互作用的蛋白（表1），分析发现它们参与了光合作用、防御反应、激素应答等多个生物过程。

图4 酵母合子细胞观察

图5 酵母阳性克隆的PCR鉴定

表1 HVUL1H08544.2互作蛋白信息

3 结论与讨论

已有研究表明，bHLH 转录因子可通过特定的结构域与靶基因相互识别并作用，激活或抑制相关基因的表达，进而调控植物的生长发育、信号转导、逆境胁迫响应等过程［12］。目前，该转录因子家族在植物抗病中的研究相对滞后，其蛋白互作网络也鲜见报道。本研究中以课题组前期从青稞中鉴定的一个受白粉菌诱导上调表达的bHLH 转录因子——HVUL1H08544.2 为诱饵，筛选出了5 个与其相互作用的蛋白，它们参与了植物光合作用、防御反应、激素应答等生物过程。 由此，推测HVUL1H08544.2 通过参与以上生物过程来调节青稞对白粉病的抗性，但要明确具体机制，后续还需进行大量的研究。

值得一提的是，酵母双杂交系统虽然灵敏性高、操作方便，但由于一些蛋白质不需要“诱饵”与“猎物”的特异性结合便能激活酵母内报告基因的表达，会导致结果产生假阳性［13］。因此，需要通过双分子荧光互补、免疫共沉淀等其他方法进一步对互作进行验证。