桔梗种子发芽率与环境因素相关性的Meta分析及商品规格等级制定

夏 莹， 那木汗， 周保昌， 许谨帆， 张 敏， 李旻辉,,

(1.内蒙古自治区中医药研究所， 呼和浩特 010020；2. 内蒙古医科大学， 呼和浩特 010110； 3.包头医学院， 内蒙古 包头 014040)

桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.) A. DC.) 为桔梗科桔梗属多年生草本植物，是一种食药同源的重要经济植物，主要分布在亚洲的东北部。因桔梗富含多种活性成分，具有显著的药理作用，越来越受到关注。由于资源保护，野生资源供不应求，目前中国已经进行大面积人工栽培桔梗，种子需求量日益增大。

“药以种为本，种以优为先”，随着中药材种子质量管理的不断深化，制定桔梗种子质量标准，对促进桔梗规范化生产和产业的发展，提高药材产量和质量等具有重要的实际意义。近年来，郭巧生等[1]、沈志君等[2]、严一字等[3]、杨成民等[4]先后针对不同产区的桔梗种子进行质量相关研究，为桔梗种子质量评价提供了一定参考，但结果不尽相同。本课题组通过检索文献，运用RevMan 5.3软件对环境因素与桔梗种子发芽率相关性进行Meta分析，同时走访桔梗主产地采集当年种子，对采集的桔梗种子进行试验，结合Meta分析和试验结果制定适宜的桔梗种子商品规格等级，旨在为桔梗种子的规范化市场销售提供参考。

1 环境因素与桔梗种子发芽率的Meta分析

影响桔梗种子发芽率的环境因素包括温度、湿度、光照、土壤等，其中主观可控因素主要为温度和湿度。检索文献发现绝大多数为温度与发芽率的关系研究，故本研究系统评价了温度对桔梗种子发芽率的影响。全面检索知网 (CNKI) 数据库，以“桔梗种子”“发芽率”为关键词，共检索到60篇文献，排除不符合要求的文献后，最终纳入符合要求的文献3篇，运用RevMan 5.3软件进行Meta分析，得出桔梗种子发芽的最适温度。以25 ℃为实验组，以15 ℃、20 ℃、30 ℃为对照组，分别进行亚组分析(见图1)。15 ℃亚组分析：共有2项研究[5-6]观察了实验组与对照组桔梗种子发芽率的变化[OR=2.69；95% CI(1.37,5.27)；p=0.004)]，研究结果表明，在25 ℃下桔梗种子发芽率优于15 ℃。20 ℃亚组分析：有3项研究[5-7]观察了实验组与对照组桔梗种子发芽率的变化(OR(95%CI)=2.28[0.88, 5.87]，p=0.09)，数据显示对于实验组与20 ℃对照组比较，差异无统计学意义(p>0.05)，可能由于数据样本量过少。30 ℃亚组分析：共有2项研究[5-6]观察了实验组与对照组桔梗种子发芽率的变化[OR=5.03；95% CI(2.66,9.50)；p<0.000 01]，研究结果显示，在25 ℃下桔梗种子的发芽率显著高于30 ℃下桔梗种子的发芽率。综合各亚组分析结果来看，25 ℃时桔梗种子的发芽率最高。

图1 不同温度与桔梗种子发芽率的Meta分析

2 桔梗种子商品规格等级标准的制定

2.1 试验材料

2016年8月至2017年10月，先后采集来自山东淄博、陕西商洛、安徽亳州、河北保定、内蒙古赤峰和重庆等6个主产区的桔梗种子，由内蒙古科技大学包头医学院的张春红教授鉴定为桔梗(P.grandiflorum(Jacq.) A. DC.) 植物的种子。

供试药品：75%医用酒精，氯化汞，吐温80，氯化三苯基四氮唑(TTC)。

供试仪器：上海一恒MGC-350 HP-2人工气候箱，电子天平，恒温箱，显微镜，烘箱。

2.2 测定方法

2.2.1种子外观形态观测

在每份成熟的桔梗种子中，随机取样数粒，置于坐标纸上，用实体解剖镜观察种子的外观形态并测量种子的大小[8]。

纳入关于桔梗种子温度与发芽率的3篇文献生成的漏斗图，散点在竖线的左右分布不对称，表明存在发表偏倚的可能性较大，见图2。

图2 桔梗种子不同温度与发芽率的漏斗图

2.2.2种子净度测定

参照种子净度分析方法[9]，利用公式(1)、(2)、(3)计算种子净度(n=3)。

(1)

(2)

(3)

式中，W1为用四分法分离后的种子量 (g)；W2为纯净种子量 (g)；W3为杂质量 (g)。

2.2.3种子千粒重测定

净度分析后，采用简便测定方法计算种子千粒重[10-11]。

2.2.4种子含水量测定

每批种子随机称样3份，参照种子检验的原理和技术对桔梗种子含水量进行测定[12]。

(4)

式中：M1为种子样品重量 (g)；M2为称量瓶恒重(g)；M3为(称量瓶+样品)干燥至连续2次称重的差异不超过5 mg后的重量 (g)。

2.2.5种子发芽率测定

将纯净种子浸泡在75%酒精中30 s取出，再用0.1%升汞溶液(加2～3滴吐温80)浸泡2 min，无菌水冲洗3次，备用。将试验用的桔梗种子洗净再用常温无菌水浸泡12 h后将种子放入垫有2层湿润滤纸的培养皿中，分别取50粒种子(3个重复，每个重复50粒)放置于温度为20 ℃、25 ℃、30 ℃的人工气候箱中培养，培养条件：湿度50%，光照强度12 000 lx，光照时间12 h·d-1，每天记录种子萌发情况，以3 d无新种子萌发则视为发芽结束，并记录最终天数[13-14]。

2.2.6种子生活力测定

将经过消毒的种子(每份样品3个重复，每个重复50粒)，于25 ℃浸种24 h，挑选相对饱满健全的种子，用刀片纵切成两瓣，将胚一分为二，然后将处理后种子置0.5% TTC 溶液中，恒温避光染色，参考种子活力测定方法手册[15]，计算桔梗种子生活力。

2.3 数据分析

试验数据均采用SPSS 20.0软件进行试验结果处理分析。

3 结果与分析

3.1 外观形态

桔梗种子为蒴果，卵状椭圆形，长2.0～3.0 mm，宽1.0～1.5 mm，厚0.6～1.0 mm，黑色或黑褐色，有光泽，种皮上分布细条纹。种翅位于种子一侧，种脐位于种子略窄一端。种子外观形态见图3。

图3 种子外观形态

3.2 种子质量指标测定结果分析

分别对不同种植地点收集到的种子进行净度、千粒重、含水量、生活力和发芽率的指标测定，结果见表1[15]。

由表1可知，6个不同种植点的桔梗种子样品净度在75.58%～97.24%之间；千粒重在0.839 4～1.075 7 g之间；含水量在5.19%～5.56%之间；生活力在91.33%～97.33%之间；发芽率中，20 ℃温度下种子发芽率在0.67%～98.67%之间，25 ℃下种子发芽率在2.67%～94.67%之间，30 ℃下种子发芽率在1.33%～87.33%之间。桔梗种子各质量指标检测值变异范围明显不同。种子净度、千粒重、生活力及发芽率的变异范围较大，这可能与不同产地桔梗种子的生产技术水平、采收期或贮藏条件等有关。通过比较分析种子发芽率测定结果可知，内蒙古赤峰市的桔梗种子萌发率最高，重庆市的萌发率最低，可以判断25 ℃为桔梗种子的最佳萌发温度，试验结果与Meta分析结果一致。

表1 桔梗种子质量指标检测结果

3.3 桔梗种子的商品规格等级标准制定

结合上述Meta分析和试验结果，制定简便、适宜、普适、可推广应用的商品规格等级标准，为桔梗种子的生产流通和药材的生产实践提供有效数据支撑，详见表2[16]和表3。

由表2、表3可知，桔梗种子的质量分级标准确定为：一级桔梗种子净度不低于95%，千粒重不低于0.9 g，发芽率不低于90%，生活力不低于98%，且具有黑色、饱满、具光泽、大小均匀、干燥、有少许瘪粒及杂质占总重量小于1%的外形特征；二级桔梗种子净度不低于90%，千粒重不低于0.8 g，发芽率不低于80%，生活力不低于95%，且具有黑色、饱满、具光泽、大小均匀、有少许瘪粒及杂质占总重量小于5%的外形特征；三级桔梗种子净度不低于85%，千粒重不低于0.7 g，发芽率不低于70%，生活力不低于92%，且具有黑色或黑褐色、较饱满、具光泽、大小不均匀、瘪粒及杂质占总重量小于10%的外形特征，各级种子含水量均小于等于70%。本标准的制定，综合考虑了影响桔梗种子质量的各种因素，科学体现各因素的重要性。经验证，桔梗种子质量等级划分合理，以上3个等级的种子规定为合格种子，在实际生产中定级时，任一指标不满足最低等级的视为不合格种子，指标不能同时满足同一等级标准要求时，按照最低指标满足的等级进行定级。

表3 桔梗种子质量等级分级次要标准

4 讨论与结论

桔梗在生长过程中，开花25 d后种子逐渐成熟和蓄积营养，在59～64 d时，种子完全发育成熟，此时种子的发芽率、千粒重都是最高的，发芽率达90%以上，千粒重在1.0～1.2 g之间。随后营养物质开始往药材根部蓄积，种子本身要进行呼吸作用消耗有机物质，导致千粒重开始下降。所以根据市场调查发现，销售的桔梗种子千粒重为0.9 g左右，而种子在储藏过程中，其发芽率也逐渐降低，结合参考文献[3,17-22]和本试验研究结果可知，在低温、低湿、低氧条件下储藏良好的种子，发芽率在80%左右。

种子含水量需适当，过度干燥会造成种子细胞质膜构造损伤严重，播种时质膜修复困难，对种子发芽产生不利影响，而含水量高的种子更易变质和霉变[23]，因而适当的含水量有利于种子的保存。依据桔梗种子脱水耐性及其保存技术相关研究[24]发现，含水量过高会降低种子活力，且桔梗种子含水量在2.5%时呈现出最高的活力。结合现有文献及本试验结果将桔梗种子各等级的含水量均定为≤7%。

本研究采用Meta分析和基础试验相结合，测定6个主产区的桔梗种子在不同温度下的发芽率，试验验证结果表明，不同产地的种子在不同温度下萌发率结果与Meta分析的结果高度一致。综合分析制定了桔梗种子商品规格等级标准，该标准具有代表性和普适性，可为桔梗种子在生产和销售过程中的质量评价以及对桔梗药材的生产实践提供有效数据支撑。

综上所述，通过把握合理的采收时间，提供良好的储藏条件，来提高桔梗种子的综合质量，从而更好的服务于中药材规范化建设。将净度、千粒重、生活力、发芽率和含水量作为桔梗种子分级的主要依据，桔梗种子的外观形态作为衡量其等级的次要依据。其中笔者引入外形特征作为分级表中一项考核指标，更简单更便捷，适合商业流通中普遍推广。