小叶龙竹种子人工老化劣变特性研究

罗玛妮娅， 张 艺， 普 甜， 郭跻敏， 王 娟， 杨宇明， 郑 元

(1.西南林业大学林学院， 云南 昆明 650224；2.西南林业大学绿色发展研究院， 云南 昆明 650233)

小叶龙竹(Dendrocalamusbarbatus)属于禾本科、牡竹属[1-3]，生长海拔为360～1 100 m，是我国南部热带地区大型经济林竹种之一，一般用于建材、编织、食用、景观用竹[4]。徐田等[4]对小叶龙竹造林方式、造林时间及幼林抚育管理方面进行研究，为小叶龙竹栽培技术的发展提供技术指导。王娟等[5]对小叶龙竹外植体愈伤组织进行诱导，建立了稳定高效的遗传转化再生体系。杨杨等[6]针对小叶龙竹丛生芽的脱分化及愈伤组织过程进行研究，发现丛芽、茎尖长出的愈伤组织效果最好，茎节次之。何巨擘等[7]筛选出最适合小叶龙竹根、芽快速繁殖与离体保存的MS培养基。杨清等[8]研究了小叶龙竹化学成分和制浆性能，纤维素含量高达51.00%，成浆容易，是一类优质的竹类纤维原料。黄美秀等[9]对小叶龙竹等12种竹子进行种子萌发和品质检验探究。尽管前人已对小叶龙竹愈伤组织的诱导、快速繁殖与离体保存、植株的再生和遗传特性、种子萌发等方面做了很多研究，但由于竹类植物种子材料难以获得，针对小叶龙竹种子活力及繁育特性的研究少见报道。

种子的老化是在种子生理成熟后发生的，主要表现在外表形态、内在结构、生理变化等方面[10-12]。目前，国内外种子贮藏研究中关于种子老化的研究报道较多。蔡春菊等[13]发现，毛竹种子在人工老化12 d时种子活力基本丧失，其生理指标与种子活力呈极显著正相关。徐敏等[14]进行了棉花种子人工老化试验，随着老化时间的增加，种子的电导率和丙二醛(MDA)含量升高，其相关酶(POD、CTA、SOD)活性下降。王健宇等[15]研究了人工老化对柳枝稷种子活力和膜透性的影响，陈禅友等[16]对长豇豆种子萌发进程中生理生化指标动态变化进行了相关研究，王仲等[17]对荷兰豆种子人工老化过程中生理生化指标的研究，刘月辉等[18]对辣椒种子老化过程进行了生理生化分析。烟草(NicotianatabacumL.)[19]、水稻(OryzasativaL.)[20]、玉米(ZeamaysL.)[21-24]、小麦(TriticumaestivumL.)[25-26]、花生(ArachishypogaeaLinn.)[27]其他农作物，白木香(AquilariasinensisL.)[28]、菊花(ChrysanthemumindicumL.)[29]等草药也有报道，但关于小叶龙竹种子人工老化处理相关研究尚未见报道。

为此，本研究以小叶龙竹新鲜种子为试验材料，通过设置高温高湿的人工老化处理环境，比较分析其种子活力与生理生化特性随老化天数的响应趋势，探索小叶龙竹种子在人工老化条件下的劣变规律，为小叶龙竹种子的贮藏及繁育研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以2018年3月在云南省红河州金平县采收的小叶龙竹新鲜种子作为材料。

1.2 处理方法

将小叶龙竹种子置于人工气候箱(宁波赛福实验仪器有限公司)，设置温度40 ℃、相对湿度95%，进行人工老化处理，连续处理19 d。分别在第1、4、7、10、13、16、19天进行取样，并测定不同老化天数小叶龙竹种子的发芽率、发芽势、含水量等生长指标，以及电解质外渗率(REC)、游离脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性等生理生化指标，以新鲜采收未经老化处理的种子作为对照(ck)。

1.3 指标测定方法

种子发芽试验采用《林木种子检验规程》(GB 2772—1996)标准发芽率测定方法并进行部分改进[13]。用滤纸作为种子发芽床，不同老化处理天数均重复5次，每重复20粒。REC测定采用DDBJ-350型电导仪外渗电导法，Pro含量测定采用酸性茚三酮比色法，POD活性测定采用愈创木酚法，SOD活性测定采用氮蓝四唑法[30]。不同老化处理天数的每个指标均重复3次，每个重复净重0.5 g种子。

1.4 数据处理

使用Excel 2010软件进行数据的整理和制图。使用SPASS 19.0软件进行数据处理和方差分析，并采用Duncan多重比较法进行差异显著性检验，不同字母表示在p≤0.05水平差异显著。

2 结果与分析

2.1 人工老化对小叶龙竹种子发芽率的影响

种子的发芽能力是反映播种品质的重要指标，种子活力通常用发芽率(绝对发芽率)、发芽势等指标表示，随着老化天数的增加获得种子发芽率的变化情况(图1)。

图1 小叶龙竹种子在人工老化条件下的发芽率动态变化

在经过人工老化处理后，小叶龙竹种子发芽率随老化天数的增加呈逐步下降的趋势，ck发芽率为72%，人工老化处理第16天种子发芽率降至0，不同老化天数下的种子发芽率差异显著(p<0.05)。在老化处理前7 d，种子发芽率缓慢下降，老化第10 天迅速下降，并在第10天以后一直处于较低水平，与ck相比发芽率显著低了61%。在老化处理16 d以后，种子失去发芽能力。

2.2 人工老化对小叶龙竹种子发芽势的影响

在经过人工老化处理后，种子发芽势随老化天数的增加呈逐步下降的趋势(图2)，发芽势与发芽率变化趋势一致，ck的发芽势为39%，人工老化处理第16天发芽势下降为0，差异显著(p<0.05)；老化第7天迅速下降，其中老化第7、10、16天之间差异显著(p<0.05)。

图2 小叶龙竹种子在人工老化条件下的发芽势动态变化

2.3 人工老化对小叶龙竹种子含水量的影响

从图3可以看出，在经过人工老化处理后，种子含水量随老化天数的增加呈下降趋势，人工老化处理第19天含水量下降至3.72%，与ck(13.32%)差异显著。小叶龙竹种子含水量与老化天数之间差异显著(p<0.05)，在老化第1天、第4～10天、第13～16天、第19天之间差异显著(p<0.05)。

图3 小叶龙竹种子在人工老化条件下的含水量动态变化

2.4 人工老化对小叶龙竹种子伤害度的影响

通过对种子进行人工老化处理，随着老化时间的增加，种子内部功能受损、细胞结构遭到破坏，电解质出现外渗的现象，随着老化天数的增加可以得到种子伤害度的变化情况(图4)。

图4 小叶龙竹种子在人工老化条件下的伤害度动态变化

人工老化处理中，小叶龙竹种子的伤害度随老化天数的增加呈上升趋势。从人工老化第1天开始伤害度不断上升，老化处理第10天略微下降后持续上升，人工老化处理第19天时伤害度达到最大峰值(46.79%)，与ck差异显著，伤害度变化趋势与种子发芽率的变化趋势相反。ck、老化第1天、第4～19天的伤害度差异显著(p<0.05)，第7～10天呈略微下降趋势，伤害度差异不显著(p>0.05)。

2.5 人工老化对小叶龙竹种子Pro含量的影响

在正常环境条件下，种子中Pro含量通常较低。在逆境条件下，Pro含量会呈现增加趋势。通过人工老化处理，可以测定种子在逆境条件下随老化天数的增加Pro含量的变化情况检验种子的生理抗性(图5)。

图5 小叶龙竹种子在人工老化条件下Pro的含量动态变化

人工老化处理中，小叶龙竹种子的Pro含量随老化天数的增加呈先上升后下降的趋势。人工老化第1～7天时Pro含量快速上升，第7天时Pro含量达到最大值(18.01 μg·g-1)，第19天达到最小值(1.42 μg·g-1)，形成一个单峰曲线，老化天数对种子的Pro含量差异显著(p<0.05)。

2.6 人工老化对小叶龙竹种子SOD活性的影响

SOD的功能是催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成H2O2和O2，减少氧自由基对植物造成的伤害，确保植物细胞正常的生命活动[31]。通过人工老化处理，测定种子随老化天数的增加SOD活性的变化情况(图6)。

图6 小叶龙竹种子在人工老化条件下SOD活性的动态变化

经过人工老化处理后，小叶龙竹种子SOD活性呈先增加后下降的变化趋势。人工老化处理第1～7天时SOD含量快速上升，第7天时SOD含量达到最大峰值(375.89 U·g-1)，随后开始下降，第19天达到最小值(224.75 U·g-1)，形成一个单峰曲线。人工老化处理第7、10、13天小叶龙竹种子SOD活性间差异显著(p<0.05)。

2.7 人工老化对小叶龙竹种子POD活性的影响

POD可进一步清除由SOD催化反应产生的H2O2[31]。通过人工老化处理，测定种子随老化天数的增加POD活性的变化情况(图7)。

图7 小叶龙竹种子在人工老化条件下POD活性的动态变化

随试验天数的增加人工老化处理的种子POD活性呈先增加后下降的趋势。老化1～7 d时POD活性不断上升，第7天时POD活性达到最大峰值[325.50U·(g·min)-1]，之后开始下降，第19天达到最低值，形成一个单峰曲线。老化处理小叶龙竹种子POD活性差异显著(p<0.05)。老化第7、13、19天小叶龙竹种子POD活性间差异显著(p<0.05)。

3 讨 论

种子贮藏过程中发芽势、发芽率是反映种子活力的重要指标[32]，蔡春菊等[13]、刘月辉等[18]、祝煜中等[22]、王玉娇等[25]针对人工老化处理对种子发芽率、发芽势指标的影响进行了研究。研究结果表明，种子随着人工老化处理天数的增加，发芽势、发芽率呈下降趋势，变化趋势先快后慢，直至种子丧失基本活力。在人工老化过程中，老化天数增加，种子活力下降，这与小叶龙竹种子人工老化试验的研究结论一致。

电导率随着老化天数的增加呈现不断上升的趋势，种子在老化过程中电导率对种子膜脂过氧化的伤害加速种子老化，导致细胞膜结构被破坏，种子活力指数与种子电导率伤害度呈显著负相关。小叶龙竹种子人工老化后电导率渗出量随着老化天数的增加呈现出不断上升的趋势，在老化第19天时达到最大峰值，在第10天有略微的下降，这可能与人工老化处理的小叶龙竹种子的生理特性和抗性有关。

通过人工老化处理，可以测定种子在逆境条件下随老化天数的增加Pro含量的变化情况，检验种子的生理抗性。SOD是一种普遍存在于动植物体内的活性氧清除酶系统的保护酶，能够催化超氧阴离子自由基发生的歧化反应，在维护细胞活性氧代谢的平衡中起重要作用[33]。POD也是植物中活性氧清除酶系统的一种保护酶，同时参与植物叶绿素的降解[34]、活性氧的产生，是植物衰老到一定阶段伤害程度的反应，可作为植物衰老的产物指标[35-36]。在前人的大量研究中Pro含量、SOD活性、POD活性等生理生化指标随着电导率伤害度的增加而降低。本研究与前人研究结论相似，但是在人工老化第7天时，Pro含量、SOD活性和POD活性均达到一个最大峰值，随后出现不断下降趋势。在人工老化处理时加大电导率伤害度，可以提高小叶龙竹种子Pro含量、SOD和POD的活性，但持续时间为7 d左右。由于老化天数的不断增加，伤害程度不断加深，种子自身内在基质已经没有能量物质的存在，所以Pro含量、SOD活性和POD的活性开始逐步下降，证明小叶龙竹种子在人工老化处理条件下种子抗逆性持续时间为7 d左右。

本研究结果表明，小叶龙竹种子在人工老化条件下的SOD活性变化趋势与POD活性变化趋势基本一致，说明SOD酶在进行催化超氧阴离子自由基发生歧化反应进行自由基、H2O2的分解，需要POD的协助，清除SOD催化反应产生、代谢过程中产生的活性氧、自由基等物质，二者都是细胞的保护酶，其作用都是为了保护种子细胞的完整性。