以线粒体为靶点治疗肝损伤的研究进展

周 兴，李雪梅，李晓辉

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院， 重庆 400054；2.重庆理工大学 药物化学与分子药理重庆市重点实验室，重庆 400054; 3.陆军军医大学 药物研究所， 重庆 400030)

线粒体是一种广泛存在于大多数细胞中的细胞器[1]，其生理结构主要由双层膜结构和基质部分组成，是细胞的“发电站”，在细胞的能量产生、新陈代谢和信号传递中起着核心作用[2]。特别是，线粒体对呼吸作用、细胞凋亡和线粒体DNA遗传至关重要[3]，其结构和功能的完整性改变可能导致三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)耗竭、活性氧(reactive oxygen species，ROS) 过度产生、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)降低、线粒体DNA(mitochondrial deoxyribonucleic acid，mtDNA)损伤等线粒体功能障碍，并进一步介导细胞的凋亡与炎症反应[4]。

肝脏是生物体主要的代谢器官，在生物合成、药物代谢、毒物清除等方面具有重要作用，维持着机体碳水化合物、脂类和蛋白质代谢的平衡，是维持机体稳态的关键器官[5]。线粒体在肝细胞发挥多种生理功能中，除了能量提供外，还参与了尿素合成、氨基酸转化等代谢功能，是维持肝细胞生理功能的重要细胞器[6]。急慢性肝病是导致世界上发病率和死亡率增高的重要原因[7-8]。近年有研究发现，线粒体损伤引起的线粒体功能紊乱，将介导ATP耗竭、ROS爆发、炎症反应、细胞凋亡等一系列细胞损伤，在丙型肝炎[9]、慢性酒精性肝病[10]及非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)[11]和药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)[12]等多种肝脏疾病的发生与发展中发挥着关键作用。

随着研究者对线粒体损伤在肝脏疾病中作用机制研究的深入，以线粒体为靶点的干预措施已逐渐成为各类肝病治疗中的新型研究策略。虽然目前临床上肝功能治疗药物仍以谷胱甘肽为代表的还原性小分子药物为主，但一系列以线粒体为靶点的新型研究策略已在药物研发中暂露头角，其中既包括小分子药物、天然多糖、蛋白多肽等大分子，还包括亚细胞治疗与干细胞治疗等新型细胞生物技术。为了更好地总结该领域过往进展，并跟踪其前沿领域，本文将从线粒体介导的肝损伤的机制及各种治疗策略2方面对以线粒体为靶点的肝病治疗进行系统地综述与展望。

1 线粒体介导肝损伤的机制

1.1 线粒体氧化应激

ROS是生物过程中氧化还原反应产生的化学活性分子[13]，它在信号转导、细胞周期调节和微生物防御等多种生理功能中发挥作用[14]。线粒体是细胞内ROS产生的主要场所，ATP合成过程，同时也伴随着ROS的产生[15]。稳态情况下，线粒体内细胞色素C等还原物质组成的抗氧化系统与线粒体内的ROS相互平衡[16]。当氧化与抗氧化平衡破坏后，特别是ROS的产生量超过抗氧化系统对ROS的清除能力时，将引起细胞的氧化应激反应，导致线粒体损伤与进一步的ROS爆发，介导线粒体功能障碍与细胞损伤[17]。

在药源性肝损伤中，因肝毒性药物导致的氧化应激介导的线粒体功能障碍是其发病的重要病理机制。其中，对乙酰氨基酚是一种常见、也最具代表性的肝毒性药物[18]。研究表明：对乙酰氨基酚对肝脏的毒性主要是因为其毒性代谢产物N-乙酰对苯醌亚胺(N-acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI)与线粒体蛋白结合，导致谷胱甘肽(glutathione，GSH) 耗竭与细胞氧化应激反应，从而触发线粒体凋亡信号通路，介导肝细胞损伤[19]。此外，双氯芬酸长期使用和过量使用也会引起药源性肝损伤，其主要机制也是由于ROS的过度产生引起的线粒体功能损伤所促发的细胞凋亡与炎症[20]。除了非甾体抗炎药外，以细胞毒性药物为主的化疗药物也易导致肝损伤。表柔比星是一种抗生素类抗肿瘤药物，其肝脏毒性主要是产生过量的ROS损害线粒体内的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性，引起线粒体功能障碍并进一步导致的急性肝毒性[21]。

除了药源性肝损伤，慢性酒精性肝病[22]、非酒精性脂肪肝(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)[23]及缺血再灌注引起的肝损伤[24]均与氧化应激介导的线粒体损伤密切相关。在慢性酒精性肝病中，长期酗酒引起的O2-和H2O2的过量产生会导致线粒体氧化应激，并进一步引起线粒体损伤、细胞损伤与炎症[25]。NASH中，肝局部炎症引起的ROS爆发，会导致脂质过氧化、细胞因子释放、线粒体损伤和细胞凋亡[26]。肝脏缺血再灌注期间肝细胞坏死也与ROS爆发引起的线粒体损伤有直接的联系[27]。

1.2 线粒体呼吸链破坏

线粒体呼吸链(mitochondrial respiratory tract，MRC) 是由大约92个核和线粒体DNA编码的蛋白质亚单位组成的，这些亚单位组成了5种不同的呼吸链复合体，分别命名为复合物Ⅰ～Ⅴ。这5种不同的呼吸链复合体共同产生了维持细胞所需的90%ATP[28]。已有研究表明：线粒体呼吸功能受损与缺血再灌注肝损伤等多种肝病相关。在缺血再灌注损伤[29]、慢性酒精性肝病[30]、NASH[31]等多种急慢性肝病中，均证实了包括线粒体呼吸复合物结构和功能的改变，从而导致肝细胞内ATP稳态破坏，引起细胞供能不足，促发细胞坏死。在缺血再灌注肝损伤模型中，因缺氧导致小鼠的线粒体呼吸功能抑制，氧化磷酸化和三羧酸循环过程均被破坏，ATP合成被抑制，从而引起肝脏和肝窦内皮细胞急性坏死[24，32]。此外，长期饮酒也会导致线粒体结构和功能的改变。在慢性酒精性肝病的大鼠模型中，研究者证实乙醇可通过抑制呼吸复合物的蛋白质合成来破坏肝脏中线粒体氧化磷酸化，从而导致ATP产生不足引起肝脏组织病变[33]。NASH患者的肝脏活检结果也显示了，在病变的肝脏组织中，存在肝线粒体呼吸链复合体活性降低和ATP耗竭的情况[34]。以上结果表明：线粒体呼吸链的结构和功能的破坏，将直接导致ATP合成障碍，促发肝细胞供能不足，从而引起缺血再灌注损伤、慢性酒精性肝病、NASH等多种急慢性肝病的发生。

1.3 线粒体膜电位降低、Ca2+超载

线粒体膜电位和Ca2+稳态是细胞死亡的决定因素[35]。Ca2+超载不仅会导致ATP产量减少，还会导致线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的过度开放，从而导致线粒体膜电位崩溃[36]。药源性肝损伤、病毒性肝炎的发生发展均与线粒体膜电位降低和Ca2+稳态失衡有直接的联系。非甾体类抗炎药对乙酰氨基酚在长期使用或过量使用后，均会引起线粒体MMP降低、Ca2+超载和MPTP激活[37]。病毒性肝病(如慢性丙型肝炎[38]、乙型肝炎[39])中，线粒体Ca2+超载、ROS过量产生和ATP合成减少会触发MPTP开放，导致线粒体肿胀和细胞死亡。除此之外，缺血再灌注肝损伤[40]、慢性酒精性肝病[41]、胆汁淤积性肝损伤[42]等肝脏疾病的发病过程中均伴随着线粒体MMP下降、Ca2+超载和MPTP的过度开放。

1.4 mtDNA损伤和释放

线粒体是人体细胞内唯一含有DNA的细胞器，mtDNA是一个裸露的环状脱氧核糖核酸，参与了线粒体功能的维持和ATP的产生[43]。mtDNA缺陷是一种严重的线粒体遗传性疾病。研究表明：mtDNA缺陷将导致严重的肝脏疾病。Goncalves等[44]研究发现在2个患有新生儿胆汁淤积症和早期肝功能不全的新生儿肝组织中编码复合物I、Ⅲ和Ⅳ的mtDNA选择性缺陷。

另外，在线粒体功能障碍中，也伴随着mtDNA损伤和释放，大面积的mtDNA损伤会加剧线粒体氧化应激，进而导致肝细胞损伤。缺血再灌注动物模型在心脏、大脑、肝脏、肾脏等器官中都显示出明显的mtDNA损伤，其中肝细胞中表现出更明显的mtDNA损伤，并加剧了线粒体氧化应激，促发了细胞的后续损伤加剧[45]。此外，凋亡的细胞将向外释放mtDNA。McGill等[46]研究发现与正常组相比，APAP诱导的急性肝衰竭组中血清中的mtDNA浓度更高。NASH患者和慢性酒精性肝病患者的血清中显示出更高的mtDNA浓度[47-48]。释放的mtDNA将进一步激活免疫系统，诱导中性粒细胞浸润肝脏炎症，加剧肝细胞损伤[49-50]。Hu等[51]发现在肝缺血再灌注损伤时释放的mtDNA，增加了炎症因子(IL-6和TNF-α) 的表达。此外，小鼠血清循环的线粒体mtDNA以浓度依赖的方式降低肝细胞活力[52-53]。

2 以线粒体为靶点的治疗肝损伤的药物研究进展

2.1 小分子药物

小分子药物一直是新药研发与药理研究的热点[54]，也是各种肝病治疗药物的主要组成类别。基于线粒体损伤在各种肝类疾病中的重要病理作用，近年来以线粒体为靶点的小分子药物的研究层出不穷，主要集中在改善线粒体的结构、功能、氧化应激等方面。

线粒体氧化应激是引起线粒体损伤的起始因素之一。谷胱甘肽[55]等还原性小分子可通过提高胞内抗氧化能力，缓解线粒体氧化应激水平，保护线粒体功能，预防或缓解对乙酰氨基酚引起的药源性肝损伤。Ling等[56]首次表明了降糖药物二甲双胍通过调节线粒体功能保护肝细胞免受三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO) 的细胞毒性作用。二甲双胍通过抑制线粒体呼吸链复合体I的活性增加了细胞内NADH/NAD+的比例，从而降低了ATO诱导的细胞内ROS水平。

MPTP通道过度开放是引起线粒体肿胀，促发细胞凋亡的重要机制。Kon等[57]报道了一种新型线粒体通透性转换抑制剂DS44170716，通过降低线粒体膜电位，阻断Ca2+进入线粒体，抑制MPTP的激活从而抑制Ca2+诱导的离体大鼠肝线粒体肿胀的发生，并保护HepG2细胞免受Ca2+诱导的细胞死亡。此外，线粒体复合物-I抑制剂鱼藤酮已证明对四氯化碳诱导的肝损伤小鼠有治疗作用[58]。Kim等[59]研究发现一氧化碳通过促进线粒体的有丝分裂和生物发生减轻了脂多糖/半乳糖胺诱导的肝损伤。Hong等[60]利用血红素氧合酶-1的诱导剂氯高铁血红素治疗缺血再灌注肝损伤，发现氯高铁血红素通过促进线粒体生物发生和线粒体自噬来减轻缺血再灌注引起的肝细胞和线粒体损伤。Ding等[61]还发现Rho激酶抑制剂通过增加复合物Ⅰ、Ⅳ以及线粒体超氧化物歧化酶活性，改善线粒体功能，从而减轻内毒素血症诱导的肝损伤。

2.2 天然化合物类药物

天然化合物类药物是来自于动植物、微生物等天然资源药物，在人类医药发展史中占有十分重要的地位。在传统中医药中，小柴胡、复方汤剂、三黄茵赤汤等中成药被证实具有肝保护作用，被广泛运用于肝类疾病的治疗中[62]。随着中医药现代化进程的推进，一些生物碱类、皂苷类、酚酸类、萜类等中药活性成分也被证实具有肝保护作用，并发现其肝保护作用的治疗靶标主要是线粒体[63]。

积雪草酸是一种五环三萜化合物，具有多种药理作用，通常被用作治疗皮肤病和创伤。Lu等[64]研究发现积雪草酸是一种轻度线粒体解偶联剂，在缺血再灌注大鼠离体肝线粒体中，积雪草酸治疗可明显改善线粒体呼吸功能，增加ATP含量，降低线粒体丙二醛水平，提高线粒体膜电位，对缺血再灌注引起的线粒体氧化损伤具有保护作用。Zhang等[65]发现从中草药黄柏中提取的去甲基小檗碱(Demethyleneberberine，DMB)是一种天然的线粒体靶向抗氧化剂，DMB可通过抑制细胞色素P4502E1、缺氧诱导因子α(Hypoxia inducible factor alpha，HIF-1α) 和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，抑制脂肪酸氧化、脂质过氧化和巨噬细胞增多，从而显著改善急性饮酒引起的氧化应激和线粒体功能障碍。绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)，是人类饮食中最丰富的酚酸之一，具有保肝作用和抗炎活性[66]。Zhou等[67]研究结果发现CGA对线粒体有明显的保护作用，可通过促进ATP生成、刺激线粒体氧化磷酸化和抑制糖酵解来改善内毒素诱导的肝损伤，表明CGA对线粒体有保护作用[68]。此外，芍药苷[69]、懈皮素[70]、咖啡酸[71]、鸢尾素[72]、红豆苷[73]、桦木醇[74]等天然化合物均已被证实可通过线粒体保护作用预防或治疗肝损伤。

2.3 蛋白质类药物

蛋白质类药物与传统的小分子药物相比具有生理活性强、特异性好、疗效高等优点，已成为21世纪药物研发的重点研究方向之一[75]。蛋白质类药物包括氨基酸及其衍生物类、多肽和蛋白质类、酶和辅酶类等药物。

Heidari等[76]研究表明：在胆汁淤积性肝损伤模型中，补充甘氨酸可降低线粒体肿胀、活性氧和脂质过氧化物的产生，提高线粒体膜电位，恢复肝脏线粒体ATP水平，并显著减轻了肝脏组织病理学变化和胶原沉积。肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration，ALR) 主要在肝实质细胞中表达，位于线粒体的膜间隙， ALR可刺激部分肝切除术后肝的再生[77]。Weng等[78]研究表明：外源性ALR可通过减轻氧化应激、提高抗氧化作用、缓解线粒体功能障碍来保护缺血再灌注中的脂肪性肝细胞。当进行脂肪性肝脏移植时，ALR可用作潜在的治疗剂。

乙型肝炎病毒感染(hepatitis B virus，HBV) 会增加慢性肝病和肝细胞癌的发病率(hepatocellular carcinoma，HCC)[79]。Yoo等[80]研究发现，线粒体E3泛素连接酶MARCH5的高表达与HCC患者存活率的提高有关。主要的原因是MARCH5与积累在线粒体中的乙型肝炎病毒x(hepatitis B viral x，HBx)蛋白相互作用并诱导其降解，从而抑制了HBx诱导的ROS过量产生、线粒体自噬和环氧化酶-2的表达。因此，MARCH5可以有效的减少HBx在线粒体内的聚集，减轻了HBV介导的肝损伤。Ampawong等[81]研究发现丝胶蛋白除了能促进胰腺和肾上腺生物合成外，它的抗氧化特性还能降低血液胆固醇水平，保护肝脏线粒体的结构和功能。丝胶蛋白主要通过调节凋亡、自噬、能量维持和抗氧化相关蛋白活性来维持肝线粒体结构，以减轻高胆固醇血症诱发的肝脂肪变性引起的肝损伤。

2.4 细胞器治疗策略

线粒体作为一种半独立于细胞的特殊细胞器，具有一定的自主性。Mccully等[82]发现生理与病理条件下广泛存在着细胞间线粒体的流动，外源性线粒体也可被细胞摄取融合。这些研究为线粒体移植提供了理论基础。线粒体移植是指将分离的线粒体植入肝脏、心脏或其他器官的受损区域，用外源性健康线粒体代替受损或功能障碍的线粒体的过程[83]。基于线粒体功能障碍是各类疾病病理过程中的关键作用，基于线粒体移植的新兴细胞器移植策略在多种肝类疾病中表现出了光明的前景。

Lin等[84]研究证明了在大鼠肝缺血再灌注损伤模型中，离体线粒体移植可通过线粒体整体修复，减少线粒体氧化应激、细胞色素C释放和肝细胞坏死，从而缓解肝脏的缺血再灌注损伤。Shi等[85]研究发现从人肝癌细胞中分离的线粒体可以用于治疗对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝损伤。外源线粒体被添加到细胞培养基中时，它们可以进入原代培养的小鼠肝细胞。当线粒体被静脉注射到小鼠体内时，它们可以到达肝脏组织中。在APAP诱导的肝损伤模型小鼠中，线粒体治疗增加了肝细胞能量供应，降低了氧化应激，因此改善了组织损伤。该研究表明外源性线粒体可能是治疗APAP肝损伤的有效治疗策略。为了使外源线粒体能靶向肝脏组织，Liu等[86]用肝脏组织的标志性蛋白去唾液酸糖蛋白载体修饰新鲜分离的线粒体，形成线粒体蛋白载体复合物，增大了外源线粒体到肝脏组织的靶向性。

尽管作为一种新兴策略，线粒体移植疗法正吸引着细胞学、药学与临床医学等多学科研究人员的目光，但线粒体来源的局限性、线粒体的不稳定性及线粒体的活性都严重限制了该策略的进一步发展。

2.5 细胞或器官移植疗法

药物诱导、酒精诱导和其他代谢性肝病都涉及线粒体损伤，并可导致肝功能衰竭和死亡[87]。除了肝移植之外，目前还没有更好的办法替代功能障碍的线粒体。然而，由于供体短缺和手术成本高，肝移植的应用在很大程度上受到限制[88]。

在此情况下，间充质干细胞因其易获得性和低免疫原性成为肝病的新治疗方案。Wang等[89]研究发现，骨髓间充质干细胞移植可以作为PHLF的一种潜在治疗方法。在肝切除术后肝功能衰竭(post-hepatectomy liver failure，PHLF)模型中，用骨髓间充质干细胞移植通过影响mTOR途径改善线粒体功能，促进脂肪酸的β-氧化，减少肝细胞的脂质堆积，治疗90%肝切除后诱发的PHLF。此外，Zheng等[90]探讨了骨髓间充质干细胞在小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型和L02肝细胞缺血再灌注损伤模型中的治疗作用及潜在机制。骨髓间充质干细胞能减少线粒体ROS的过量产生，减少线粒体碎片的积累，恢复ATP的生成和上调线粒体有丝分裂，改善了肝缺血再灌注损伤中肝细胞的凋亡。

虽然，干细胞治疗对线粒体功能恢复的机制仍有待进一步探索，但间充质干细胞治疗策略已被证实是一种有效的快速恢复线粒体功能的疗法，特别是，对于肝衰竭或缺血再灌注损伤引起的严重损伤而言，具有十分重要的临床意义。然而，干细胞来源、数量及癌变等问题仍限制着该策略未来的临床应用。

3 结论

引起线粒体损伤的主要机制包括线粒体氧化应激、线粒体氧化呼吸链破坏、线粒体膜电位降低、Ca2+失调、mtDNA损伤和释放。肝细胞线粒体损伤将进一步介导细胞胞内的ROS爆发与细胞凋亡信号，并释放炎症因子和mtDNA，形成肝脏组织局部炎症，对于肝细胞凋亡、肝脏炎症形成等均具有十分重要的病理作用。因此，线粒体已逐渐成为各种肝病治疗策略研究的热门靶点。目前临床上市的主要以小分子药物和天然药物为主。蛋白大分子药物则在靶点特异性方面有明显的优势，但目前的发展仍较为缓慢，且其临床应用仍受限于蛋白分子的免疫原性、半衰期等成药性问题。尽管相对于器官移植，线粒体移植和干细胞移植更具低成本与可能性，但在其作用机制、来源、成本、免疫原性等方面仍有待突破性的研究成果。

随着线粒体在各类肝病发生发展机制研究的深入，以线粒体为靶点的药物研发将逐渐取得更多突破，从而在各类肝病的治疗中取得更具突破性的治疗效果。