miRNA研究向结直肠癌临床转化应用的现状

李晨，杜晓辉

(解放军总医院普外科，北京 100853)

随着社会生活方式多元化的改变，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)防控面临着前所未有的挑战，我国已将CRC纳入精准扶贫专项救治九大病种之一。目前基因工程研究虽然在CRC诊治方面取得了可喜的成绩，但诸多研究仍停留在实验室阶段，即便涉及临床应用的研究，细胞水平研究仍占多数，仅有少部分进入动物实验阶段，能够用于临床的非常有限。转化医学作为连接基础研究和临床治疗的“桥梁”和以将医学科学发现转化为临床实际运用为宗旨。我国的国家转化医学中心建设尚处于起步运作阶段，但已成为落实健康中国国策和促进我国经济社会发展创新驱动战略的重要生力军[1]。“以转化医学为核心”的医学研究理念，正在引领国内医疗多学科临床应用的不断突破，通过不断提升医疗技术，更好地惠及患者。将微RNA(microRNA，miRNA)实验室研究成果转化为临床成果，并加速两者之间的转化，已成为业界共识。CRC缺少早期检测手段，手术治疗受到相关适应证的制约，且缺乏有效的术后复发及化疗监控措施[2]，防控形势严峻。现对目前miRNA在CRC早期筛查及CRC手术过程的临床转化应用现状予以综述。

1 miRNA在CRC早期筛查中的临床转化应用现状

由于我国工业化、城市化进程的加快，我国常见癌症谱同时表现出发达国家和发展中国家的双重特征，其中CRC的变化尤为突出。CRC发病人数剧增，患者发病年龄结构与世界CRC发病年龄结构逐渐接近，由老年人群向青壮年人群转变[3]；且男性发病居高不下。miRNA在CRC早期筛查中的临床应用起步较早，其中CRC粪便、血液miRNA检测已开始临床应用，但组织miRNA检测仍处于实验室阶段。miRNA作为CRC分子生物标志物，完成CRC早期筛查的miRNA临床转化并将其应用于临床诊治还面临许多问题。

1.1粪便miRNA检测CRC的现状 粪便标本易采集，故粪便miRNA检测在CRC早期筛查中的应用比较广泛。miRNA具有高度稳定性，Lee等[4]发现，体液中miRNA对于核糖核酸酶(Rnases)的自我消化具有抵抗能力，且粪便样本中miRNA也保持在一定的浓度。

miRNA在CRC筛查中具有一定优势。Choi等[5]报道，早期CRC患者粪便中肿瘤细胞含量高，易被检出。对粪便miRNA表达筛查CRC的敏感性及特异性的多变量分析显示，miR-92a和miR-144与大肠癌的发生显著相关，粪便miR-92a和miR-144检测大肠癌的敏感性和特异性良好。研究显示，miR-29a、miR-224、miR-17、miR-20a、miR-21、miR-92、miR-224均在粪便中高表达[6-7]。

粪便内环境复杂恶劣、经过漫长的通道和漫长的时间排出体外、人RNA占比偏小是miRNA检测临床应用的主要问题。粪便miRNA作为的CRC诊断标志物，需进一步优化标本采集、标本分离、标本提取和检测技术等粪便miRNA检测程序，从而大幅度提升标本的可测性、再现性[8]，以真正实现CRC粪便miRNA检测从实验室研究到临床应用的转化。

1.2血液miRNA检测CRC的现状 miRNA可以被分泌到细胞外，是细胞微环境和机体体液中的重要调控分子，在人体外周血中保持着一定浓度。研究发现，CRC患者血清中某些miRNA异常表达[9-11]。ElSharawy等[12]分析了血清miRNA携带颗粒的有效浓度是否可作为检测生物标志物的基础，结果发现，在742个miRNA标本中，其中45个CRC标本的全血清和颗粒浓缩血清存在显著差异，提示通过检测血清miRNA载体可以检测CRC相关的病理变化。

目前临床常用的癌胚抗原、糖类抗原(carbohydrate antigen,CA)19-9、CA125诊断结直肠癌的灵敏度仅为50%～65%[13]。CRC患者外周血中miRNA的生物学活性和稳定性良好，具有获取方便、容易保存、不易降解等特点，且筛查CRC的特异性、敏感性较癌胚抗原、CA19-9、CA125等标志物更具优越性。

血液的稀释效应对单位体积miRNA起始含量的影响限制了血液miRNA检测CRC的临床应用，导致血液miRNA检测的准确性无法保证；细胞溶血及细胞碎屑可能直接降低检测标本的敏感性。目前，仍需要大样本多中心的CRC血液miRNA检测的验证，为临床提供准确、安全、高效的检测方法。

1.3组织miRNA检测CRC的现状 目前，CRC组织miRNA检测以基础研究为主，通过不同miRNA在CRC及癌旁正常组织的异常表达确定异常表达miRNA的目的靶基因，根据靶基因不同作用靶点，阐述CRC的调控机制。双荧光素酶报告基因检测法是目前应用最广泛的miRNA靶基因结合位点鉴定方法，相关研究通过荧光素酶报告基因分析证实了不同miRNA靶基因的结合位点，miR-143靶向作用于结肠癌转移相关基因1的3′非翻译区；miR-152通过靶向磷脂酰肌醇-3-激酶在CRC中发挥抑癌作用；miR-150靶向作用于p53凋亡刺激蛋白家族抑制性成员的3′非翻译区；miR-382可以靶向作用于核受体家族成员2的3′非翻译区[14-17]。

不同miRNA靶基因的确定为揭示CRC的发病机制奠定了基础。不同miRNA在CRC发病过程中的作用不同。针对miRNA在CRC发病的不同节点、不同环境、不同条件、不同特征，挖掘并制订相关诊疗措施成为可能。目前，针对CRC组织的miRNA检测较广泛，涉及数百种miRNA，以基础研究为主，基础研究对发病机制的揭示是实验室科研成果应用于临床的基础及关键。

CRC患者粪便、血液、组织分子标志物检测的应用率仅为20%～30%，其在健康筛查中的应用率更低。价格昂贵、检测技术不成熟、检测标准不统一、检测流程不规范、检测周期较长均是影响粪便、血液、组织分子标志物检测临床推广应用的主要原因。此外，临床工作者对CRC的miRNA检测认知度差、执行力不足等亦制约了CRC粪便、血液、组织中分子标志物检测的临床应用，进一步加强CRC检测技术临床转化的研究，使实验研究尽可能地满足临床需要并临床应用于临床实践，将有利于提高CRC的检测率和检测质量，大大提高CRC的早期诊治效率。

2 miRNA在CRC手术过程中的临床转化应用现状

目前手术治疗仍是CRC首选的最重要、最有效的治疗方式之一[18]。为提升手术质量，学者们尝试将miRNA检测转化应用于CRC手术全过程，包括术前手术适应证的选择、术中观察手术前后miRNA的变化、术后复发及化疗敏感性的监测。

2.1miRNA检测在CRC术前的应用 手术适应证的选择是确保手术治疗成功的基础，目前CRC的手术适应证仍以美国肿瘤联合会制订的癌症TNM分期为基本依据。TNM分期既是临床判断CRC病情严重程度的重要标准，也是制订CRC诊疗策略的基本指南[19]。miRNA在CRC患者术前检测的应用，对CRC手术治疗较局限，仅对临床早、中期(即TNM分期Ⅰ、Ⅱ期)CRC患者有效，对TNM分期Ⅲ、Ⅳ期的CRC效果极差，甚至无效。为解决这一难题，2016年新修订的第8版癌症分期系统引入了新的分子标志物[20]。

随着对miRNA与TNM分期的关系的深入研究，Arabsorkhi等[21]研究发现，miR-298的异常水平与CRC肿瘤分化、TNM分期和淋巴结转移有关。Hong等[22]报道，miR-497-5p表达水平低与CRC患者TNM分期高、淋巴结转移显著相关。Wang等[23]揭示miR-511-5p表达降低与组织学分化、侵袭和TNM分期呈负相关。Hu等[24]在探讨miR-1229通过靶向同源结构域相互作用蛋白激酶2促进血管生成的机制研究中发现，exomiR-1229水平显著升高，与肿瘤大小、淋巴转移、TNM分期和生存不良显著相关。

miRNA引入TNM分期系统，作为TNM分期的一种补充，极大提升了TNM分期的准确性、有效性及实用性[25]。根据CRC患者术前miRNA检测水平，依据肿瘤侵袭程度，淋巴结转移范围和有无远端脏器的转移综合评估TNM分期，使手术适应证的选择更加准确、有效，有助于开展个体化治疗，提高精准化治疗水平。分子检测手段从实验研究进入临床应用，标志着开启了结直肠癌“分子诊断和治疗”的新时代。

2.2miRNA在CRC术中检测的应用 miRNA在CRC发生发展过程中呈现动态变化[26]，Maierthaler等[27]比较了miR-122对非转移性与转移性CRC预后的影响，转移性CRC无复发率和总生存期以及转移发生率均高于非转移者。新近研究发现，CRC患者miR-221-3p及miR-133a-3p过表达时，患者生存期较短[28]。

miRNA在病程不同阶段的特征性演变特征，引发了学者们对CRC患者手术前后miRNA变化的关注。Ogata-Kawata等[29]通过对比CRC患者与健康人群血清16种外泌体来源的miRNA，结果发现其中7种miRNA(miR-21、let-7a、miR-23a、miR-1229、miR-150,miR-1246,miR-223)的含量在CRC患者血清中显著升高，且均在经过手术治疗后，表达水平明显下降。Wu等[30]证实，结直肠癌和高级别瘤变腺瘤患者术前粪便脱落细胞中miR-135b的表达较健康人群升高，术后表达量下降明显，认为miR-135b可作为检测CRC和晚期腺瘤的生物学标志物，并能检测手术治疗效果。Fang等[31]研究发现，与健康对照组相比，CRC患者术前血浆miR-24、miR-320a和miR-423-5p表达水平明显降低，而术后临床好转CRC患者血浆miR-24、miR-320a和miR-423-5p表达水平明显升高。因此，CRC患者手术前后miRNA的动态变化，可作为判断手术效果的间接证据，可能对提升手术质量有一定的积极意义。

2.3miRNA在CRC术后检测的应用 CRC患者术后面临两大问题，即患者术后复发的检测和术后化疗的选择。通常术后复发与转移是CRC患者死亡的最重要原因。据统计，CRC术后患者的转移率高达50%[32]。对于手术治疗CRC患者，有效监测术后病情变化并及时发现复发转移倾向可为早期进行临床干预提供依据[33]。目前，术后复发多依赖组织病理学检查确诊，由于病理标本的获取受到多种因素的影响，常规病理检查发现术后复发具有一定的局限性。近年来，应用miRNA检测预测手术复发，引发了大家的关注。有报道称，miR-21与miR-92联合检测预测术后CRC复发的灵敏度为80.6%，特异度为95.3%[34]。

手术后联合化疗作为中晚期CRC的主要治疗方法，现广泛应用于临床。常用化疗药物的多药耐受性是CRC治疗面临的主要障碍之一。面对CRC对化疗药物治疗应答差的难题，学者们针对miRNA在蛋白转运、凋亡蛋白及细胞周期调控等重要环节做了大量研究。Li等[35]研究miRNA通过转运蛋白对化疗敏感性影响发现，miR-34a能抑制ABC转运蛋白泵出细胞内过量药物，从而提高化疗效果及化疗敏感性。Liu等[36]认为，miR-15可能通过调控凋亡蛋白影响化疗患者对5-氟尿嘧啶或奥沙利铂诱导的细胞凋亡水平，增加药物的敏感性。Xu等[37]研究发现，miR-503-5p可通过促凋亡蛋白p53上调凋亡调控因子调控CRC的耐药性。研究表明，miR-139-5p有诱导CRC细胞在G0/G1或S期阻滞的作用，在miR-139-5p转染细胞化疗后，对化疗制剂具有更高的敏感性[38-39]。Ye等[40]应用化疗药物5-氟尿嘧啶常规化疗方案发现，miR-141能增强化疗后的肿瘤细胞药物敏感性，其机制可能通过靶向细胞周期蛋白D2发挥作用。

miRNA对化疗敏感性调控，还包括对坏死蛋白调控、基因转录过程调控、DNA损伤修复等环节。目前，关于miRNA预测CRC患者预后和评估化疗药物反应的研究较多，但存在一些问题，如miRNA特征不重叠，所得实验结果可重复性差，且相关报道的研究结果存在矛盾。因此，CRC药物治疗应答差的问题急需解决。

3 miRNA在CRC临床转化应用中的难点及研究热点

近年来，肿瘤诊治相关基因工程取得了巨大进展[41]，国内研究者通过对miRNA癌症协会数据库提供的可检索分析的PubMed数据库建库至2017年3月所有关于人CRC中miRNA的近400多篇文献进行分析发现，涉及诊断的miRNA研究约占18/160，涉及治疗的miRNA研究约占15/160，涉及预后的miRNA研究约占41/160，涉及增殖及转移的miRNA研究约占60/160，其中有部分是重叠使用相互交叉的研究，以处于细胞水平且涉及临床应用的研究占多数，仅有少部分研究进入动物实验阶段，能够应用于临床的研究非常有限[42]。可见，真正实现miRNA与CRC之间的临床应用转化仍任重道远。

由于miRNA分布广泛、作用靶点多样、调控方式复杂，不同种类miRNA功能之间存在重叠性、相似性。目前，同一种miRNA对不同肿瘤的作用存在不一致性、不均一性或截然相反的作用，其内在规律还未被充分认识和掌握，是基础研究向临床应用研究发展的重要难点，成为转化应用研究的研究热点[43]。

3.1miRNA基因表达多态性及调控复杂性对CRC临床转化应用的影响 人类健康的需求是推动科技发展以及促进miRNA研究向CRC临床转化应用的巨大动力。为攻克基因表达的多态性及调控的复杂性的影响，众多科研人员付出了长期艰辛的劳动。

癌症基因组图谱[44]运用生物技术、信息技术等一系列分子研究技术和医学前沿实验研究技术，进行生物标志物的分析与鉴定、验证与应用，为miRNA研究的CRC临床转化应用、诊治及精准医疗和个性化靶向治疗提供了基础条件。个性化靶向治疗是miRNA基础研究的突破口，也是最受临床期待的一种治疗方法[45]。为成功实现CRC临床转化，首先要重视基因表达多态性及基因调控网络复杂性的研究。

miRNA作为CRC的辅助治疗，具有广阔的应用前景。临床miRNA模拟物的开发[46]以及miRNA拮抗剂的研制[47]成为miRNA应用临床的主要方式。RNAi干扰技术是验证miRNA通过调整相关基因起作用的可靠技术，随着该技术的成熟，miRNA模拟物及其拮抗剂逐渐应用，可能成为抗肿瘤转移治疗潜在的治疗靶点[48]。

miRNA模拟物可通过化学方法合成，在鉴定与确认miRNA靶标时发挥主要作用。miRNA模拟物制作过程简单，不需要构建载体，转入的细胞量可控、可调整，常用作临床肿瘤治疗剂。早在2015年，miRNA模拟物的临床开发已出现。利用纳米技术加工处理miR-150并制成药物制剂，采用介入疗法将其缓慢置入体内肿瘤细胞，以缓慢提升细胞内miR-150水平，发挥类似miR-150的生物学效应，从而更大限度地发挥miR-150在肿瘤发生发展过程中的抑癌作用，开创了miRNA模拟物临床应用的先河[49]。

miRNA拮抗剂通过阻止miRNA与相应靶基因的互补配对抑制miRNA作用，其优势是稳定性高、抑制效果强于普通抑制剂、给药方式灵活且方便。导入特定miRNA拮抗剂或与miRNA前体的发夹或茎环部分结合，使其不能被Dicer加工生成成熟的miRNA，亦可与miRNA上oncomiRNA结合序列结合，进而抑制后者和特定靶miRNA结合，从而保护靶miRNA。miRNA拮抗剂可逆转具有促癌作用的基因功能，发挥抑癌效应。Chen等[50]报道，应用miR-451拮抗剂可有效抑制CRC的迁移和增殖。

miRNA作为新型特异性分子靶标，参与了肿瘤诊断、治疗的过程，现已明确的与肿瘤相关的miRNA有千余种，但仍缺乏对其系统、全面、多方位的认知与了解。进一步加强对基因表达多态性以及对基因调控网络复杂性的深刻认识是miRNA基础研究向CRC临床转化的重点。

3.2miRNA目的基因安全性及质粒载体稳定性对CRC临床转化应用的制约 目前，目的基因载体构建(vector construction)技术[51-52]在miRNA临床转化研究中应用最广泛。含外源DNA质粒的构建是载体构建的核心技术。质粒作为运载体，实质上是一种运输工具，负责将DNA分子运送到受体细胞，并使装载外来DNA片段的受体细胞继续履行复制功能。在人工质粒构建过程中，为了确保质粒的安全性、稳定性、便捷性，科研人员做了大量的尝试与努力。

传统载体构建多用腺病毒和慢病毒，病毒载体转染效率高，但由于病毒本身的生物学特性，存在致病性、复发性、不确定性、不可控性以及难以大量制备等缺点，限制了其临床应用。同时，由于缺乏相关载体动物模型，影响了其临床应用。

使用非病毒载体进行质粒构建已成为当前miRNA临床转化研究的首选[53]。近年来非病毒载体的研制与开发为人工载体构建开辟新的视野。使用非病毒载体有助于解决腺病毒和慢病毒载体的种种弊端。有研究者已成功采用脂质纳米粒子，并将miR-21包装为成熟的miRNA，以此为载体运送至肿瘤组织、肿瘤细胞及全身各系统[54]。非病毒载体的研制(在品种、有效性、准确性方面)真正应用于临床肿瘤治疗，仍需要一个漫长的过程。

3.3miRNA检测技术限制了CRC临床转化应用 在基因治疗中，实验技术往往决定了研究的成败。实验技术的成熟和进步，使基础理论研究向临床转化成为可能，能够促进实验室前期研究向临床治疗后期研究的衔接和过渡。目前，miRNA检测技术尚不完善、不成熟，限制了其临床转化应用。

miRNA检测的常用方法包括经典印迹杂交(Northern blot)、微阵列芯片(Microarray)、实时荧光定量聚合酶链反应以及测序法，它们都存在检测过程繁琐、费时、敏感性低、操作难、重复性差、成本高、不稳定等缺点。滚环扩增是目前较成熟的miRNA扩增技术，其优势在于可在短时间内使miRNA分子数量倍增，使检测信号放大，以更多地应用于临床监测；荧光原位杂交技术结合滚环扩增可在短时间内实现细胞内miRNA的定位以及定量分析，对研究细胞内miRNA的功能及相关疾病发生的分子机制有重要意义；而基于特异性酶辅助检测以及纳米孔检测等技术，可明显增强荧光信号的优点，提升检测的敏感性[55-57]。Duan等[58]利用信号放大机制运用等温扩增体系处理核酸外切酶和切口酶，有效解决了目标靶基因触发及寡核苷酸单链合成工程中的灵敏度检测问题，大大提高了miRNA检测技术的敏感性。

近年来，对于提高miRNA检测技术临床应用可重复性及可操作性的研究较多，如系统检测实施同一患者粪便、循环、癌组织；在正常人、CRC癌前病变患者及不同阶段CRC患者中建立系统完善的miRNA差异表达谱，将有助于建立一套完善的、符合国人体征、适合中国国情的CRC筛查体制和临床诊治机制。

4 小 结

在现代医学科学由“循证医学”“转化医学”向“精准医学”的重要转变过程中，“转化医学”起着承上启下的作用。基于CRC临床诊治的miRNA研究是成功实现转化的基础；准确选择miRNA向CRC临床转化应用的路径是成功实现转化的关键；克服miRNA在CRC临床应用中的难点是成功实现其临床转化的标志。目前miRNA临床转化研究亟待解决的主要问题包括关键技术、关键环节、突出问题(如DNA测序技术开发、外泌体介导的miRNA研制)，此外应加快miRNA激活剂及抑制剂的研制，开发更多、更安全的非病毒载体，以尽快解决miRNA分子治疗中输送途径的安全问题。未来miRNA在CRC临床转化应用中将发挥重要的作用。