无创产前基因检测技术的临床应用及研究进展

覃茜

（百色市妇幼保健院，广西 百色，533000）

出生缺陷的发生已受到我国重点关注，主要是指胚胎或胎儿在发育期间，所出生结构或功能代谢异常，主要包括染色体异常、先天畸形、遗传代谢性疾病以及功能异常。相关数据统计，我国出生缺陷发生率可达到4%—6%，已被归纳为高发国家[1]。目前，临床针对该类疾病我国医学界尚无最佳治疗措施，一般通过染色体疾病的产前筛查及诊断，尽早判断出生缺陷疾病，同时利用早期干预或终止妊娠，来规避出生缺陷发生率[2]。既往，临床以血清学筛查、超声产前诊断以及侵入性产前诊断为胎儿染色体疾病常用手段，其中超声诊断项目包括多类，如三级彩超筛查、胎儿颈项透明层（NT）检查[3]。而血清学主要于孕早期或孕中期，利用检测孕妇血清学生化标志物+NT，并依据孕周、体重、糖尿病史、吸烟史等因素，综合性判断胎儿染色体疾病[4]。临床研究发现，血清筛查检出率为60%—70%，但其漏检率普遍较高，进而增加唐氏综合征患儿出生风险[5]。侵入性产前诊断可归纳为绒毛活检、羊膜腔穿刺以及脐静脉穿刺，均属于创伤性诊断，且伴有实验周期长等特点，且具有0.5%—1%的流产风险[6]。因此提供一类检出率高、无创的诊断措施，已成为临床医师探究的热点。而染色体非整倍体无创产前基因检测（NIPT）属于一类新型技术，也是基于孕妇外周血中胎儿游离DNA 新型产前筛查技术，通过采集孕妇静脉血，分离血浆，并提取血浆内游离DNA，通过高通量基因测序措施，实施深度测序，同时依据生物信息学探究技术，判断胎儿患染色体异常疾病风险。本文对NIPT 原理、优势依据局限性进行综述如下：

1 NIPT 原理

相关学者于1997 年发现，通过常规聚合酶链式反应（PCR），母体外周血血浆内Y 染色体特异DNA 片段进行扩增，证实母血浆内伴有胎儿游离DNA，进而开展了通过母血中胎儿游离DNA（cell－free fetal DNA，cffDNA）实施无创产前诊断新途径[7]。另学者研究发现，以孕妇血中胎儿游离DNA 为模板，通过全基因组，大规模平行基因检测测序技术对胎儿21 染色体非整倍体实施研究，为NIPT 开辟重要途径[8]。孕妇外周血血浆内游离NDA属于胎儿及母体游离DNA 的混合物，该指标的来源，以母体自身细胞降解为主，极少部分属于凋亡胎盘滋养层细胞，该类细胞释放NDA，能够为胎儿遗传物质游离DNA 片段扮演重要角色。研究发现，于妊娠7 周胎盘循环建立后，即可于孕妇外周中判断稳定cffDNA，其浓度可依据孕周增大，而随着上升，且平均半衰期为16min，于正常分娩2h 后，于母体外周血中尚未检出，故本次妊娠实施产前检测结果，未受到上次妊娠干扰[9]。同时胎儿游离DNA 均以小片段形成存在，平均为166bp。结合胎儿游离NDA 以上特点，使孕妇外周胎儿游离DNA 实施产前筛查，成为可能。

2 NIPT 检测平台

NIPT 的建立，与高通量测序技术存在密切联系。现阶段，应用于NIPT 检测项目高通量测序技术已逐渐完善，以Illumina、Ion Torrent 以及BGI 三大平台为核心，其中Illumina 通过边和成边测序方式，利用桥式聚合酶链式反应（PCR）和可逆性末端总结作为关键技术，测序期间需将基因组DNA 随机片段合理放置光学透明玻璃表面，该类DNA 片段可经过延伸和桥式PCR 扩张后，于Flow cell 上形成数以亿计的DNA簇，且具有数千份一致模板单分子簇[10]。同时能够通过带荧光基团的4 类特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止SBS 技术，对待测模式DNA 实施侧讯，以文库构建简单为主要特点，且无需实施PCR 环节，错误率较低，测通量大，以测序读长较短[11]。而Ion Torrent 属于一类尚无光学感应的测序项目，通过半导体测序为核心，选择一类布满小孔的高密度半导体芯片，每个小孔就有一个测序反应池，若一个受到单克隆序列，覆盖磁珠而进入小孔后，开始测序反应，可依据顺序一次流经4 种碱基[12]。若产生碱基插入时，PH 变化，可受到反应池感应器所感应，将化学信号逐渐转化为数字信号，进而读取DNA 序列，其以测序速度快为优势，以单个碱基重复问题为缺陷。BGI 通过DNA纳米球（DNA Nanoball，DNB）配合探针锚定聚合测序（cPAS）技术，通过一类经特殊表面修饰规则阵列芯片，每个修饰位点固定于一个DNA 纳米球，阵列芯片修饰位点距离一致，能够确保不同纳米球光信号未互相影响，进而强化信号处理的合理性，以准确性高、测序通量大为优势[13]。

3 NIPT 应用状况及局限性

3.1 应用指征(1)孕早期、孕中期血清学筛查，反映胎儿染色体非整倍体风险，进而被归纳为临界高风险孕妇。（2）属于感染性疾病活动期，介入性产前诊断禁忌者[14]。（3）伴有习惯性流产、试管婴儿等孕妇，且在知晓同意下，可选择无创产前基因检测；（4）孕周过大，错过现阶段产前诊断最佳时间孕妇；（5）孕妇及家属对介入性产前诊断存在一定恐惧，在知情同意状况下，可实施NIPT[15]。

3.2 NIPT 应用及问题近年来，NIPT 已在临床得到广泛应用，该技术可有效规避孕妇，因侵入性产前诊断，而增加流产风险，同时可强化胎儿染色体非整倍体疾病的检出率，规避佳阳性率。相关数据统计，传统血清学筛查检出率为60%—70%，具有较高的漏检率，且伴有5%假阳性率[16]。另研究证实，NIPT 对21、18、13－ 三体综合征检测的准确率分别可达到99.4%、97.4%以及92.5%，而假阳性率分别为0.2%、0.5%以及0.8%。NIPT 对21 三体、18 三体与13 三体综合征，均具备较高准确率，且伴有假阳性率低等特点，已被归纳为临床产前筛查的首选，有效弥补血清筛查的不足[17]。但临床研究发现，由于该技术的发展的限制，使其检测结果尚无定位金标准，仍无法替代有创性产前诊断技术[18]。而NIPT 检测性染色体非整倍体敏感度及特异性较21、18 以及13 一三体综合征低，导致该类检测差异原因具有多类，如（1）测序自身因素，受到X 染色体GC 碱基含量便移，加之X 和Y 染色体记序列较为一致。（2）限制性胎盘嵌合以及胎儿嵌合，进而对胎儿染色体DNA 真实状况掩盖[19]。故上述因素，可对胎儿性染色体非整倍提示异常孕妇，后续需实施有创的羊水染色体核型分析，以规避染色体非整倍体假阳性的出现风险[20]。

4 小结

随着NIPT 技术已在临床得到逐步普及，NIPT 临床应用技术规范的出台，使其经验得到进一步积累，NIPT 能够有效减少出生缺陷儿，规避侵入性产前诊断而诱发的不良风险。我们相信，NIPT 技术能够在我国产前筛查、产前诊断中起到关键作用，且具有广阔临床使用前景及价值。