药品中N-亚硝胺类基因毒性杂质分析方法研究进展

李昊 耿红江 管清磊 王其宏

摘要：众所周知，基因毒性杂质具有突变性和致癌性，会对DNA造成极大的损伤，进而严重危害人类的生命健康。此外，自“缬沙坦事件”后，N-亚硝胺类基因毒性杂质成为了业界内的研究热点。本文介绍了在药品领域的N-亚硝胺类基因毒性杂质分析方法研究进展，主要包括前处理方法和定量方法，旨在为广大研究者针对药品基质中N-亚硝胺类化合物的分析方法选择、开发和验证提供思路。

关键词：基因毒性杂质;N-亚硝胺;分析方法;研究进展

【中图分类号】R97             【文献标识码】A             【文章编号】2107-2306（2021）0910--02

1.研究背景

基因毒性杂质也被称作遗传毒性杂质，是指能够直接或间接损伤细胞DNA，并导致基因突变和可能引发癌变的化合物。N-亚硝胺是指亚硝基的氮原子与氨基中的氮原子相连，并在氨基上发生取代反应而生成的一类化合物。此类化合物已被多项报道证明具有强突变性、强致癌性和高毒性，必须严格控制。

N-亚硝胺类化合物的结构通式为R2（R1）N-N=O，主要结构类型有7种：N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N- 亚硝基二丙胺（NDPA）、N-亚硝基二丁胺（NDBA）、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）、N-亚硝基乙基异丙胺（NEIPA）和N-硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）。N-亚硝胺类化合物具有多种生成方式，主要包括仲胺类化合物与亚硝酸之间的相互作用，叔胺类化合物与一氯胺之间的亲核取代反应，溶剂N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的氧化，橡胶硫化剂与空气中氮氧化合物相互作用和药物在存储或运输过程中不稳定基团（如二甲氨基）的降解。

自2018 年7 月华海药业在缬沙坦原料药中检测出微量的NDMA，并触发了欧盟审查和导致大量原料药在国内外被召回后，N-亚硝胺类杂质就在药学领域受到了广泛关注。近三年内，越来越多的药物中被检测出此类杂质：2018年10月，EMA报道：印度的两家药企Hetero Labs和Aurobindo Pharma 生产的部分沙坦类药物中也含有NDEA和NMBA，因此，EMA 将审查范围扩大至所有沙坦类药物。后来，在其他类药物中也陆续发现了N-亚硝胺类杂质：2019 年9 月到2020年4月，FDA 报道先后在雷尼替丁和二甲双胍 中检测出NDMA。2020年4月，FDA 发布公告：召回美国市场上雷尼替丁产品，该公告中提到某些产品中的NDMA 含量会随着时间推移而有所增加，进而可能导致杂质含量高于可接受水平。同月，Amneal Pharmaceuticals 的3批尼扎替丁口服液中NDMA含量超过可接受水平，因此公司将该3批产品召回。截至目前，EMA 已将N-亚硝胺类杂质的审查品种扩大至7 种，也就是上述提到的7种。按照目前的发展趋势，未来可能还会有更多的药物被检出此类杂质，因此药品行业各方必须给予高度重视。

2.分析方法

N-亚硝胺类杂质广泛存在于熏烤和腌制食品、化妆品、污水及烟草中，因此在这些领域的研究比较成熟，但是在药品领域关于此类杂质的研究报道却比较少[1]。尽管在上世纪70年代针对药品中的N-亚硝胺类化合物的研究就已经开展，然而之后的三十多年则进展缓慢[2]。直至2018年“缬沙坦事件”后，随着各国药监部门对N-亚硝胺类杂质越来越重视，对于此类杂质的多种分析方法也被陆续发布。分析方法包括两部分：前处理方法和定量方法。前处理方法包括用溶剂直接溶解、过滤、离心、萃取等;定量方法常见的有气相色谱法（GC）、液相色谱法（HPLC）以及色谱-质谱（MS）连用法，如GC-MS、GC-MS/MS、LC-MS、LC-MS/MS，此外还有热能分析法（TEA）、紫外光谱法（UV）等。

2.1 气相色谱法（GC）

N-亚硝胺类化合物大多挥发性较好，极性较大，因此GC法通常作为检测此类化合物的首选方法，也是最早被发现的方法[3]。GC 的进样方式包括直接进样和顶空进样（HS）：前者更适合高沸点和热稳定性强的物质，但基质污染较大，前处理过程往往较复杂;后者的前处理过程较简单，基质污染少，但是对于不易挥发、高沸点和热稳定性强的物质不太适用。分析N-亚硝胺类化合物，直接进样常用溶剂为低沸点溶剂，如二氯甲烷（DCM）、乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）;而顶空进样常用溶剂为高沸点溶剂，如N-甲基吡咯烷酮（NMP）、二甲基亚砜（DMSO）。

早在40年前，有研究者就用GC-TEA法对含氨基拉明、二硫磷和土霉素的药物进行N-亚硝胺类化合物的检测[3] 。结果表明，在几乎所有药物中均检测到NDMA，最低检测限可达1μg·kg-1。咸瑞卿等[4]建立了一种用GC-TEA检测缬沙坦原料药及制剂中NDMA含量的方法，結果证明，该方法专属性强，线性范围宽至10～1000ng·mL-1，检测限低至3ng·mL-1，回收率为94%～100%。GC-TEA法作为最早被报道的方法，虽然分析N-亚硝胺类化合物专属性较强，但TEA检测器价格较昂贵，应用范围相对较窄，因此未能得到广泛应用。

2.2 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）

GC-MS法目前在测定N-亚硝胺类化合物方面得到了较为广泛的应用，该法利用了质谱仪的准确、快速、灵敏度和分辨率高等优点进行定性和定量分析。GC-MS的离子源类型主要有电子轰击离子源（EI）和化学电离源（CI）两种，分析器主要是单四极杆（MS）和三重四极杆（MS/MS），一般情况下，三重四极杆可降低基质干扰（共流出物的碎片或同位素峰）引起的假阳性的发生率，因此三重四极杆的灵敏度和准确度更高。

李俊等人[5]报道了用GC-MS直接进样法测定坎地沙坦酯中微量NDMA和NDEA。他们在前处理时先用0.2mol.L-1氢氧化钠溶液溶解样品，然后用乙酸乙酯进行萃取，尽管在样品中检出环己醇，但是对NDMA和NDEA的测试没有干扰。结果表明，NDMA和NDEA定量限分别为0.06μg.g-1和0.03μg.g-1;NDMA和NDEA的平均回收率分别为88.7%和89.2%，证明该方法准确度好，灵敏度高，简便可靠，最重要的是前处理方式减小了基质干扰。另外，姜俊等人[6]采用HS-GC-MS来减少基质干扰：他们在测定厄贝沙坦中NDMA和NDEA时，以NMP溶解样品后通过顶空进样方式进行测试，此方法有效地避免了直接进样时高浓度基质组分对色谱柱和气化室的污染，也减少了基质对待测物测定的干扰。测试结果表明，NDMA 和 NDEA 在 10～500ng /mL浓度范围内线性关系良好;NDMA和 NDEA的 定量限分别为5.18ng/ml和13.74ng/ml;NDMA回收率在103.5～104.6%，NDEA回收率在100.6～103.2%。说明该方法能够有效地检测厄贝沙坦原料药中 NDMA 和 NDEA 的含量。

除了沙坦类药物，有的研究者们同样用GC-MS法在其余药物中也检出N-亚硝胺类杂质。文松松等人[7]建立了GC-MS 法测定盐酸二甲双胍原料药及制剂中痕量NDMA。他们直接以二氯甲烷作为提取溶剂，提取时间为30min。结果显示，NDMA 的定量限为0.5ng/ml ;回收率为93.2%～97.9%;重复性低于7%。以上結果说明本方法灵敏度高、结果准确且重现性好。蔡英杰等人[8]采用GC-MS 法测定头孢呋辛钠中NDMA 和NDEA。他们以乙腈溶解、振荡、离心后取上清液进行测试。结果表明，NDMA 和NDEA 的定量限分别为0. 12μg/mL 和0. 04μg/mL;回收率为101. 7%～106. 3%。该方法操作简单，能够有效地检测头孢呋辛钠中这两种杂质的含量。

2.3 液相色谱法（LC）

采用液相色谱法（LC）分析N-亚硝胺类杂质，关于这方面的报道比较少，主要原因是LC法适用的杂质限度通常在100ppm以上，但是各国药品监管部门普遍对N-亚硝胺类杂质限度要求及其严格，目前EMA 和FDA 对N-亚硝胺类杂质要求不得超过30ppb。因此，LC法的灵敏度不足限制了其在基因毒性杂质领域内的应用。各国药品监管部门中，只有法国国家药品和保健品安全管理局发布了HPLC-UV法检测缬沙坦原料药及制剂中NDMA。

2.4 液相色谱- 质谱联用法（LC-MS）

液相色谱- 质谱联用技术（LC-MS）具有高灵敏度、高分辨力、快速分析、结果准确的特点，能够满足痕量毒性杂质测试的要求。此方法已逐步取代LC法用于痕量杂质的分析，在基因毒性杂质领域（尤其是挥发性和热稳定性较差的杂质）应用较广泛。另外，LC-MS法相对GC-MS法灵敏度更高，离子源和分析器种类也更多。离子源最常用的是电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）;分析器除了单四极杆（MS）和三重四极杆（MS/MS）外，还包括飞行时间分析器（TOF）、轨道阱（Orbitrap）和离子阱（Iontrap）等。目前应用最广泛的分析方法是LC-MS/MS，尤其是对于限度较低（<1 ppm）的杂质而言，此法是最合适的，因为LC-MS/MS 方法可降低基质干扰造成的假阴性（离子抑制）或假阳性（共流出物或同位素干扰）发生可能性，可以满足较严格的灵敏度、专属性和准确度要求。

研究者们在近三年内陆续报道了用LC-MS法测定各种药物中N-亚硝胺类杂质。陈鸿玉等人[9]采用超高效液相色谱-大气压化学电离-三重四极杆质谱联用法（ UPLC-APCI-MS/MS） 测定盐酸雷尼替丁胶囊中NDMA。他们用甲醇溶解样品，而后经振摇、离心和过滤，最后取上清液进行测试。测试模式为正离子多反应监测（MRM）模式。结果表明，在1～500 ng·ml-1 范围内线性关系良好;回收率在99. 7%～103. 7% ;定量限为1ng·ml-1。因此该方法专属性好、线性范围宽且线性关系良好、准确度和灵敏度都高、操作简单，可以较好地满足雷尼替丁胶囊中NDMA 的分析检测。章为等人[10]同样用UPLC-APCI-MS/MS 法测定二甲双胍格列吡嗪片中NDMA含量。他们直接用水做提取剂，其他前处理过程与上述测定盐酸雷尼替丁胶囊中NDMA时相同。测试模式同样为正离子MRM模式。得到的结果：NDMA 在1.0699 ～106.99ng·ml-1范围内线性关系良好;回收率在87.9% ～ 90.3%;定量限为0.89ng·ml-1。该方法操作简便、灵敏度高、准确度好，可用于二甲双胍格列吡嗪片中NDMA 的测定。

虽然LC-MS法在分析N-亚硝胺类杂质方面已得到广泛应用，但是大多数被报道的分析方法同时检测的杂质种类较少，通常少于3种。为解决此问题，袁松等人[11]建立了UPLC-MS/MS法测定奥美沙坦酯中7 种基因毒性杂质：NDMA、 NDEA、NEIPA、NDIPA、NDBA、NMBA、NDPA。他们用甲醇直接溶解样品并稀释，定量测试方法采用APCI 离子源正离子扫描和MRM模式。结果显示，各杂质浓度在1～100 ng/mL 内具有良好线性关系;样品加标回收率为87%～106%;定量限为0.06～0.65ng/mL。因此该方法灵敏度高、专属性强、结果准确，可用于定量测定奥美沙坦酯原料药中7 种N-亚硝胺类杂质，有效地扩充了同时检测的杂质种类。

LC-MS法在分析N-亚硝胺类杂质方面通常采用四极杆分析器（MS），但是也有研究者开发出利用高分辨质量分析器（TOF、Orbitrap）分析此类杂质的方法：徐文峰等人[12]采用高效液相色谱- 四极杆飞行时间质谱（LC-Q-TOF-MS）测定氯沙坦钾及其复方制剂中NMBA。他们用加0.1% 甲酸水溶液作为提取剂，质谱采用ESI和正离子扫描模式。结果：NMBA在5～100ng·ml-1范围内线性关系良好;定量限为2.1 ng·ml-1;平均回收率为89.2%;重复性、溶液稳定性均符合药典要求。所以本方法可用于氯沙坦钾及其复方制剂中NMBA 的定量测定。高分辨质量分析器以其超高分辨力和灵敏度以及超快分析速度的优点，今后也许会在分析N-亚硝胺类杂质方面得到越来越多的应用。

3.总结与展望

自从缬沙坦中被检出NDMA 后，被检出N-亚硝胺类化合物的药物范围不断扩大，从沙坦类到替丁类、二甲双胍类……未来可能还会有更多的药物被检出此类杂质。如此严峻的形势下，各制药企业、科研院所、检测机构以及药品监管部门对该类基因毒性杂质的控制势必会越来越重视，定会制定和发布更加科学合理的分析方法及控制策略。为了避免或尽量减少N-亚硝胺类杂质对人类健康带来的风险，建立便捷、高效、准确、灵敏的分析方法迫在眉睫。但目前在此类杂质分析方法开发方面仍然存在两大难点：一方面，如何选择合适的前处理方法，既要尽可能减少N-亚硝胺类化合物的损失，又要尽可能减少基质污染，从而保证测试的稳定性和准确度;另一方面，如何建立通用、简便、灵敏度和准确度高、稳定性好、成本低的定量方法，以保证该方法可适用于行业内大多数单位。相信随着研究者们的不断努力探索，以上两大难点会逐步得到破解。本文为药品N-亚硝胺类基因毒性杂质的分析方法开发提供参考，以便更加严格控制此类杂质限度，进而保证药品质量安全。

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