激光显微切割条斑紫菜叶状体的参数优化*

曹逸飞, 李小姣, 曲伟华, 茅云翔，2**, 杜国英**

(1. 中国海洋大学海洋生命学院， 山东 青岛 266003； 2. 海南热带海洋学院水产与生命学院， 海南 三亚 572022)

条斑紫菜是重要的经济海藻之一，为大型多细胞红藻，其叶状体具有精子囊、果孢、营养细胞等多种组织分化。紫菜中分离细胞有多种办法：酶解法，即用海螺酶酶解紫菜获取原生质体，海螺酶是研磨粒蝾螺消化腺制成的粗酶液[1]，这种粗酶液是一种没有准确成分的混合物，酶解效率不稳定且酶解原生质体发育成叶状体细胞比例较低；机械破碎[2]和氧化胁迫法[3]，通过迫使紫菜碎片放散无性的单孢子获得分离的细胞，单孢子可再发育成叶状体。这些方法多是进行大量紫菜处理，其目的是获取大量单孢子而非分离特定细胞，而分离特定细胞时往往进行手工切割[4]，由于实验人员的操作水平和设备条件限制，往往会引入杂质或者取材不均一。目前高等植物中常用激光显微切割技术(Laser Microdessection，LMD)从样品中精确分离特定组织或细胞类型的目的细胞进行后续研究。

本研究中使用的LMD系统型号为Leica LMD 7000，由德国Leica公司制造生产。该系统采用正置显微镜，利用电脑精确控制的355 nm紫外显微激光光束切割样品，收集系统使用样品自身重力收集，不需要借助其他任何装置，同时减少了实验消耗并避免了污染，并可搭载不同类型载物系统完成不同实验。由于该系统只能切割单层细胞，目前多使用石蜡、冷冻切片技术以满足单层细胞样品制备，且需要进行染色处理从而提高不同细胞类型的辨识程度，最低可分离直径1 μm的样品[5]。固定与染色处理都会导致细胞的死亡，因此LMD多用于动植物转录组、基因组研究以及少量无需进行固定、染色的动物、微生物成活细胞团分离，在藻类中鲜有应用。条斑紫菜具有单层细胞结构、组织形态特征明显，无需额外进行切片、固定和染色的优势，具备经过制片与切割流程的优化分离成活细胞的可行性。运用LMD技术分离的细胞团可用于多种后续研究，如精确分离不同品系紫菜的精子囊与果胞进行杂交实验；精确分离不同部位、不同时期、不同类型的细胞进行细胞发育、生长速率测定等实验。

本研究系藻类中首次应用LMD技术从样品中分离活细胞团，拟从条斑紫菜制片方法、干燥时间、切割参数、切割直径等方面建立各种类型细胞团所适用的切割参数体系。为评估切割后的细胞受激光胁迫程度，本研究采用无损的叶绿素荧光显微成像技术检测细胞的光合活性，结合细胞成活率共同作为细胞活力的指标。

1 材料与方法

1.1 材料培养

室内培养条斑紫菜纯系RZ(PYL201306-440)，取长度约3 cm、宽度约0.5 cm的幼苗叶状体，长度约25～30 cm、宽度约4～5 cm的成熟叶状体。培养条件为：温度10 ℃，光强60 μmol photons·m-2·s-1，光暗比L∶D=12 h∶12 h。切割前培养于2 L通气瓶中，切割后的细胞团培养于自制的腔室载玻片中。

1.2 样品前处理及制片

取生长状况良好长势相似的条斑紫菜叶状体，在干净的灭菌海水中漂洗表面可能附着的多余盐分及杂质，用镊子将叶状体撕成含有目的细胞的小碎片。在钢框载玻片薄膜中央滴加100 μL灭菌海水，将叶状体均匀展平，尽量多吸去水分，以免水分吸收激光能量造成切割困难。

1.3 激光显微切割处理

1.3.1 不同干燥时间 在干燥15、30、45、60、90 min(从制片完成开始计时)时切割直径为300 μm的成熟条斑紫菜营养细胞细胞团，每株紫菜在临近区域切割五次，五次平行实验(各样品切割均提前在非目的区域进行预切割，筛选出适合当次切割的较小激光能量，最大程度减少激光能量对细胞的损伤，下同)。

1.3.2 不同材料 选择成熟、幼苗条斑紫菜顶部(将紫菜沿纵轴平均划分为10部分，取最顶端)和基部(取最底端)的中央(将紫菜沿横轴平均划分为5部分，取最中心部分)与边缘(取最外侧部分)位置细胞，切割直径300 μm的细胞团，每株紫菜在临近区域切割五次，五次平行实验。

1.3.3 不同切割直径 选取成熟条斑紫菜顶部细胞与幼苗条斑紫菜基部细胞，分别在6.3、10、20倍镜下切割直径300和200 μm细胞团；在6.3、10、20、63倍镜下切割直径150和100 μm细胞团，每株紫菜在临近区域切割五次，五次平行实验。

1.4 细胞成活率测定

分别统计细胞团中成活细胞数量与细胞总量，切割边缘的破碎细胞不纳入统计范围。细胞成活率=(成活细胞/细胞总量)×100%。

1.5 叶绿素荧光参数测定

显微切割条斑紫菜获得的细胞团(见表1)，应用叶绿素荧光成像技术测定光合活性。测定前暗适应20 min，由于直接在载玻片上进行制片，水分含量低，极易蒸发从而引起细胞的失水胁迫，进行影响测量结果。为避免细胞失水，直接对腔室载玻片中培养的细胞团进行测定，可为细胞提供稳定的液体环境且便于后续培养或者连续观察，最大程度确保测量的准确性。使用显微多光谱荧光动态成像与光谱分析系统(Fluorescence kinetic microscopy，FKM，捷克PSI)，于40倍显微镜头下，对细胞团内部活细胞密集区进行荧光淬灭曲线(Quenching curve)测定，程序设定如下：

表1 显微切割样品

FlasheBlue=8，ActinicBlue=20；FlashGreen=0，ActinicGreen=0；FlashRed=0，ActinicRed=0；FlashDRED=0，ActinicDRED=0；FlashFAR=0，ActinicFAR=0；Super=35，Sensitivity=35；Act1=20，Shutter=2。

培养24 h后再次进行测量，对照组设置为未经切割的同株紫菜临近部位。

2 实验结果

2.1 细胞形态变化

高能激光能量切割时的局部的高温和高光强会对细胞造成严重的损伤，且越靠近切割边缘影响程度越深。切割后的细胞团内细胞可分为三类：死亡细胞、受损细胞、成活细胞(见图1)。死亡细胞内容物流出，细胞形状变为不规则多边形，透光度增加，细胞变透明。受损细胞体积增大，色素体无法清楚观察。成活细胞维持原有细胞形态，呈圆形，颜色深，可以清楚观察到中心色素体。

(a. 成活细胞；b. 死亡细胞；c. 受损细胞。a. Living cell; b. Dead cell; c. Damaged cell.)

2.2 干燥时间对细胞成活率影响

经过不同时间干燥处理后，切割获得的直径300 μm的成熟紫菜细胞团成活率见图2。在制片后短时间内，由于细胞内的自由水与制片时无法避免带入的水分会吸取大量激光能量，并且还可能偏折激光，致使无法完成切割过程。细胞成活率随干燥时间延长下降，干燥45 min后成活率大幅度下降。为保证较高的细胞成活率，通常在30 min内完成切割流程。

图2 不同干燥时间对细胞成活率影响

2.3 材料选择对细胞成活率影响

切割所得直径300 μm的不同类型紫菜细胞团成活率见图3。精子囊细胞成活率可达到(81.5±6.0)%；成熟紫菜顶部中央细胞与边缘细胞成活率分别(62.8±22.3)%、(48.8±15.3)%；紫菜幼苗基部中央细胞与边缘细胞成活率分别为(35.8±12.3)%、(29.6±11.3)%；其他组别细胞成活率均低于20%。不同类型的细胞团成活率由高至低为：精子囊、成熟紫菜顶部、紫菜幼苗基部、成熟紫菜基部、幼苗顶基部，相同区域的中央与边缘细胞切割后成活率相近。

(M=成；T=顶；C=中；E=边；B=底；S=幼；Spe=精子囊。M=mature；T=top；C=center；E=edge；S=seedlin；B=botom；Spe=spermatangium.)

2.4 切割直径对细胞成活率影响

成熟条斑紫菜在6.3倍镜下切割所有细胞团细胞几乎全部死亡，10倍镜仅适用于直径300 μm以上细胞团切割，细胞成活率高于30%，20倍镜适用于直径150～300 μm细胞团切割，细胞成活率在(27±6.37)%～(37.2±6.24)%之间，63倍镜是唯一适用于切割直径100 μm细胞团的参数选择，细胞成活率为(9.98±3.82)%，其余倍镜下的细胞几乎全部死亡，仅20倍镜下有微量细胞存活，成活率为(0.67±0.32)%(见图4A)。幼苗紫菜在低倍镜下具有更高的成活率。在6.3倍镜下切割直径200～300 μm细胞团成活率在7.3%～24.3%之间；10倍镜是最适用于幼苗紫菜切割的参数选择，切割直径300、200 μm细胞团的成活率为(39.7±15.1)%、(19.7±7.0)%，且10倍镜是唯一能切割直径150 μm幼苗紫菜细胞团的选择，但细胞成活率较低为(3.3±0.15)%；20倍镜下切割直径200、300 μm细胞团成活率略低于6.3倍镜；而直径100 μm的细胞团在各个倍镜下均全部死亡(见图4B)。

(A. 成熟条斑紫菜；B. 幼苗条斑紫菜。A. Mature P. yezoensis; B. Seeding P. yezoensis.)

2.5 细胞团的叶绿素荧光参数

2.5.1Fv/Fm变化Fv/Fm为暗适应后的最大原初光量子效率，反应植物的最大光合效能。成熟条斑紫菜Fv/Fm为0.29±0.028，幼苗条斑紫菜Fv/Fm为0.37±0.013，24 h后再次测量同一部位Fv/Fm数值基本保持稳定(见图5)。成熟紫菜切割细胞团Fv/Fm均发生显著(p<0.05)下降。其中300 μm基部与顶部细胞团、150 μm基部与顶部细胞团、100 μm顶部细胞团可以维持一定水平的Fv/Fm，较对照组分别下降约79.9%、58.9%、57.9%、31.4%、76.6%。培养24 h后，300 μm基部与顶部细胞团较培养前升高53.6%、90.0%；150 μm基部细胞较培养前升高33%。其他组别上升幅度均小于20%。幼苗紫菜细胞团则在低倍镜下能维持较高水平的Fv/Fm，400与300 μm细胞团Fv/Fm下降均不超过27%。培养24 h后，300 μm顶部细胞较培养前上升22.6%，其他组别上升幅度均小于20%。

(基Bottom；顶Top。A. 成熟条斑紫菜；B.幼苗条斑紫菜。6.3倍镜切割直径400 μm、10倍镜300 μm、20倍镜150 μm、63倍镜100 μm。表示差异性显著，P≤0.05；表示差异性极显著，P≤0.01。A. Mature P. yezoensis; B. Seeding P. yezoensis. 6.3 len means 400 μm dissection diameter;10 len means 300 μm dissection diameter; 20 len means 150 μm dissection diameter; 63 len means 100 μm dissection diameter, similarly hereinafter. means significant difference, P≤0.05；means hishly significant difference, P≤0.01.)

2.5.2Y(Ⅱ)变化Y(Ⅱ)即光稳态下实际光量子效率,它可以反映有热损耗存在时，PSⅡ反应中心完全开放时的光化学效率。成熟与幼苗条斑紫菜对照组的Y(Ⅱ)均为0.1±0.01，培养24 h后仍均为0.1±0.01(见图6)。各材料组别变化趋势与Fv/Fm变化一致。

(基Bottom；顶Top。A. 成熟条斑紫菜；B. 幼苗条斑紫菜。倍镜与直径关系及含义见图5。 A. Mature P. yezoensis; B. Seeding P. yezoensis. The corresponding relation between lens and diameter and the meoring of is shown in the Fig.5.)

成熟紫菜300 μm基部与顶部细胞团、150 μm基部与顶部细胞团、100 μm顶部细胞团可以维持一定水平的Y(Ⅱ)。培养24 h后，多个组别发生较大幅度上升， 其中150 μm顶部细胞团上升幅度最高约为95.6%。幼苗紫菜400与300 μm细胞团以及150 μm基部细胞团保持较高水平的Y(Ⅱ)，且恢复培养后上升幅度较小。

2.5.3qN变化qN即非光化学淬灭，可以反映植物耗散过剩光能为热的能力。成熟与幼苗条斑紫菜对照组qN分别为0.34±0.59、0.28±0.029；培养24 h后分别为0.33±0.034、0.28±0.033(见图7)。成熟条斑紫菜300 μm顶部、150 μm基部与顶部细胞团较对照组无显著上升，300 μm细胞团基部细胞上升33.4%。幼苗条斑紫菜400与300 μm细胞团qN均保持原有水平甚至部分组别略有下降，150 μm细胞团基部细胞较对照组上升44.2%。培养24 h后，除幼苗紫菜400 μm细胞团顶部细胞较培养前上升29.2%，其他各组别变化均在20%以内。

(基Bottom；顶Top。A. 成熟条斑紫菜；B. 幼苗条斑紫菜。倍镜与直径关系见图5。 A. Mature P. yezoensis; B. Seeding P. yezoensis.The corresponding relation between lens and diameter is shown in the Fig.5.)

2.5.4qP变化qP即光稳态光适应光化学淬灭，可以反映PSⅡ聚光色素吸收光能用于电子传递所占份额。成熟条斑紫菜对照组qP为0.41±0.067，幼苗紫菜qP为0.29±0.028；培养24 h后分别为0.42±0.097、0.30±0.034(见图8)。与对照组qP相比，成熟条斑紫菜除300 μm基部细胞团，150 μm顶部与基部细胞团下降幅度幅度较小外，100 μm顶部细胞团下降50.7%。而幼苗紫菜同样在400与300 μm细胞团基本保持原有qP水平，150 μm细胞团基部细胞较对照组下降51.0%，顶部细胞下降62.3%。培养24 h后，各组别变化幅度均不超过20%。

(基Bottom；顶Top。A. 成熟条斑紫菜；B. 幼苗条斑紫菜。倍镜与直径关系见图5。 A. Mature P. yezoensis; B. Seeding P. yezoensis.The corresponding relation between lens and diameter is shown in the Fig.5.)

3 讨论

激光显微切割仪本质上是以紫外激光作为能量，以细胞自身重力进行收集的机械切割方法，被切割细胞的受伤程度，由外向内逐渐减少。通常而言，细胞成活率随切割直径升高而升高。研究中发现，当切割直径超过400 μm时，细胞团自身重力较大，在切割还未完成时，细胞团已切割部分会发生卷曲，激光极易对细胞团进行二次切割，严重降低细胞的成活率。Podgorny等[6]利用LMD分离直径200～600 μm的成活HeLa细胞，Zhou等[7]利用LMD分离的成活拟南芥平均直径约为500 μm，而本研究提供直径100～400 μm的切割方案，可以分离成活同质细胞。

水分和激光能量相互拮抗，高含水量帮助细胞吸收激光灼烧产生的高温，避免失水胁迫，提高细胞的成活率，但由于自由水和结合水中含有的微小颗粒对激光具有吸收和散射作用[8]，又要求使用较高的能量才能成功切割样品，反过来又会降低细胞成活率。条斑紫菜是潮间带生物，自然条件下可以干露10 h以上[9]，但在显微镜的近距离光照下，干燥超过1 h再进行切割，细胞几乎全部死亡，考虑到切割多个样品的操作时间，通常干燥15 min即可开始切割，总切割时间控制在30 min之内。具体切割参数与材料批次，空气湿度、温度等有关，切割前应在非目的区域进行试切割，调整选择适合的参数。

实际切割过程中发现，不同倍镜不仅是视野改变，同样的激光参数，其切割能力也会改变，不同仪器设备之间同样可能具有差异，本研究仅从本仪器进行讨论。据观察，激光在6.3、10倍镜下的发散程度明显高于20、63倍镜。在切割能力相同的条件下，激光能量越发散，相应的激光强度越高，因此需要比较不同倍镜下切割相同直径细胞团细胞成活率。研究表明，6.3倍镜适合切割直径300 μm以上细胞团，10倍镜适合切割300 μm以上细胞团，20倍镜适合切割150～300 μm细胞团，63倍镜适合切割100-150 μm细胞团。

本研究发现，以各类型细胞所适用的低能量参数分离的成熟、幼苗紫菜顶部、基部细胞成活率具有明显不同，这可能与细胞形态、细胞分布、细胞抗逆性等多种因素有关。杨晓玲等研究表明，紫菜基部细胞的直径及细胞壁厚度高于顶部细胞，且成熟紫菜细胞直径及细胞壁厚度高于幼苗紫菜[10]。总体而言，成熟紫菜的细胞成活率高于幼苗紫菜，这与用刀片进行进行机械切割的结论相符[11]。具体分析这种现象的可能原因：在6.3、10倍镜下切割要求使用较高的激光能量，能量对细胞成活率起到主导作用。成熟细胞细胞壁厚，细胞体积大含水量高，需要进一步提高能量，最终导致切割后的细胞几乎全部死亡；而幼苗紫菜则可使用较低能量进行切割，内层细胞受激光辐射影响较轻微，仅外缘细胞死亡。在20、63倍镜下激光能量集中，无需高强度能量即可完成切割，但由于切割直径减少，内层细胞同样会受到较强的影响，此时细胞自身的抗逆性起到主导作用。成熟紫菜细胞的抗逆性强，细胞成活率较高，63倍镜100 μm切割条件下，顶部细胞团中央细胞仍存活，但基部细胞全部死亡，其原因可能是基部细胞体积大，每个细胞都有部分位于外缘位置，受损严重导致细胞死亡；幼苗紫菜顶部细胞在20倍镜150 μm条件下几乎全部死亡，而基部细胞由于细胞体积大，具有较强抗逆性得以成活，但63倍镜100 μm切割条件下幼苗紫菜全部死亡。

在激光切割后，Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qP大多发生显著下降，qN发生显著上升，该变化趋势与其他失水[12]、高温[13]、高光[14]胁迫下的变化趋势一致。部分受损严重的细胞团，其Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qP测量值接近0，qN测量值接近1，细胞的PSⅡ反应中心完全关闭，与黄磊等人测量受到严重高温胁迫的蓝莓细胞一致[15]。细胞团培养24 h再次测量，Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qP大多上升，qN下降，变动幅度大多在20%以内，这种差异可能是实验误差造成的。但变化幅度超过20%的测量组如300 μm成熟细胞Fv/Fm、Y(Ⅱ)，400 μm幼苗基部细胞qP、300 μm成熟顶细胞qN等变化可能与受损细胞培养后恢复光合活性有关。这些变化幅度较大的细胞团均具有较高的细胞成活率，所受的激光胁迫均在细胞自我保护能力限度内。这种细胞自我修复引起的叶绿素荧光参数变化与黄纯倩等[16]、Akbar等[17]趋势一致。本研究中，Fv/Fm、Y(Ⅱ)的变化趋势明显，是反映细胞受损程度的灵敏指标，该参数也常用于其他紫菜胁迫实验中[18-19]，但Fv/Fm、Y(Ⅱ)会在培养后发生较大改变，部分组别甚至发生90%以上程度的上升现象，建议培养至少24 h后再进行测量，获得较为准确的细胞光合活性。

4 结语

本研究首次在条斑紫菜中应用激光显微切割技术，建立了利用激光显微切割技术分离成活紫菜细胞的流程，为紫菜的细胞分离提供了精确、快捷的全新方法。结合细胞成活率与叶绿素荧光参数评价切割细胞团活力，结果表明：成熟条斑紫菜适宜在高倍镜(如20、63倍镜)下分离直径100～300 μm细胞团；幼苗条斑紫菜适宜在低倍镜(如6.3、10倍镜)下分离直径200～400 μm细胞团，细胞成活率可到达20%～60%，细胞的光合活性可达到原有水平的40%～100%。