新型冠状病毒疫情下细胞学标本固定后的蜡块制作体会

刘 甜，任家材，张世英，任俊奇，袁静萍

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)作为一种急性呼吸道传染病，可通过飞沫、气溶胶等方式进行传播[1]。病理科细胞室工作人员在日常工作中，会接触确诊或疑似COVID-19患者的痰液、胸腔积液、腹腔积液等标本，这些标本在离心包埋过程中易产生气溶胶污染以及液体飞溅导致的体液污染，因此如何在细胞学制片的技术环节阻断生物安全隐患对医务人员的安全防护具有重要意义。新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)属于β属的冠状病毒，对紫外线和热敏感，56 ℃ 30 min、75%乙醇、含氯消毒剂等脂溶剂均可有效灭活病毒，病理科常用的福尔马林、戊二醛也可以通过烷基化反应有效灭活SARS-CoV-2[2]。然而，笔者发现福尔马林固定后的细胞学标本常常发生细胞固缩，尤其是细胞学涂片标本细胞固缩较为严重，对诊断影响较大，但福尔马林对免疫组化影响不大。如果将固定后的细胞学标本收集制作细胞蜡块，结合免疫组化可达到明确诊断的同时预防SARS-CoV-2感染传播效果，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料选取2020年3月武汉大学人民医院病理科细胞室接收的胸、腹腔积液标本3例作为研究对象，所有标本SARS-CoV-2核酸检测均为阴性，但为防止可能的感染，病理细胞室在岗技术人员接收标本时仍需重点做好三级防护措施，应戴口罩、手套、护目镜、穿防护服。

1.2 方法将接收后的细胞学标本一部分作为固定组，按照细胞学标本与100%福尔马林原液10 ∶1的比例混匀后(福尔马林浓度为10%)固定4～6 h后再离心。剩余细胞学标本作为未固定组，采用传统方法，即不加固定液直接离心。离心后的标本按照常规操作制作细胞涂片和细胞蜡块，分别采用瑞氏-吉姆萨染色和HE染色观察细胞病理形态，若细胞蜡块HE染色切片中查见肿瘤细胞，进一步行免疫组化染色。免疫组化染色采用EnVision两步法，抗体购自DAKO公司。

2 结果

2.1 福尔马林固定对细胞涂片瑞氏-吉姆萨染色的影响未固定组制作出的细胞涂片，脱落细胞形态结构异型性明显，细胞呈团片状分布，核质比高，细胞质蓝染，染色质及核膜清晰，可以分辨细胞类型(图1)；经福尔马林固定后，镜下见细胞数量减少，细胞呈团状分布，细胞核皱缩明显，结构不清，未见明显细胞质(图2)，对诊断影响很大。

2.2 福尔马林固定对细胞蜡块HE染色的影响固定组与未固定组中细胞蜡块HE染色均可见大量散在分布的肿瘤细胞，部分呈巢状分布，细胞异型性明显，细胞质强嗜酸性，细胞核呈毛玻璃状(图3、4)。相对于未固定组，固定组中福尔马林对细胞形态学有一定的影响，可见细胞皱缩，细胞核形态模糊，胞质内沉淀增加。此外，比较固定后的细胞涂片和细胞蜡块中的细胞形态，可见福尔马林固定对细胞蜡块中细胞形态学的影响低于细胞涂片。

2.3 福尔马林固定对细胞蜡块免疫组化染色的影响由于细胞涂片细胞量通常较少，而细胞蜡块含有大量散在分布的肿瘤细胞，具有组织学形态，可通过免疫组化进一步辅助判断肿瘤细胞的来源及分类。笔者发现福尔马林固定对免疫组化影响较小：固定组与未固定组中免疫组化染色背景均干净，细胞质(图5、6)、细胞膜(图7、8)及细胞核(图9、10)的阳性着色部位均正确，且特异性强，无非特异性着色。

3 讨论

COVID-19作为一种急性呼吸道传染病已被纳入《传染病防治法》规定的乙类传染病，并要求采取甲类传染病的预防与控制措施[3]。病理细胞室会接触感染性标本，包括未灭活的含SARS-CoV-2的标本，如痰、支气管灌洗液、纤维支气管镜涂片和胸、腹水标本等。因此，对细胞学标本进行固定灭活尤其重要，以防止生物安全感染。福尔马林对各种病原体(细菌、芽胞、病毒等)有强大的灭活作用。据报道，0.05%～0.25%甲醛在6～12 h内能杀死细菌、芽胞及病毒，1%～2%甲醛在几分钟内可杀死普通细菌，4%甲醛15 min可杀死炭疽芽胞、结核杆菌及多数病毒。病理科常用福尔马林原液(即40%甲醛)以体积比1 ∶10比例固定细胞学标本以防止胸水变质退变，同时也能达到对标本固定灭活的作用[4-5]。

福尔马林虽然具有灭活病毒和标本固定的作用，然而经福尔马林固定后的细胞胞核染色加深，细胞形态易皱缩。笔者发现细胞学标本固定后制作的细胞涂片细胞量减少，细胞核皱缩明显，结构不清，未见明显细胞质，无法明确诊断，因此防疫期间尽量避免细胞涂片的特殊操作。虽然福尔马林固定使细胞蜡块中细胞形态皱缩，但相比于细胞涂片，福尔马林固定对细胞蜡块中细胞形态学的影响较小，我们仍然能够从固定后的细胞蜡块HE染色中观察到大量散在分布的肿瘤细胞，究其原因可能是细胞涂片一般细胞量少，无组织结构，经福尔马林固定后细胞缩小更易脱落，因此残余的散在分布且皱缩明显的细胞对诊断影响较大，而细胞蜡块收集的细胞丰富且集中，有较好的组织结构，类似于组织蜡块，而福尔马林对组织收缩较小，因此福尔马林对细胞蜡块中的细胞形态学整体影响小于细胞涂片。另一方面，细胞蜡块还可以通过免疫组化进一步明确诊断肿瘤细胞类型及来源。福尔马林固定液主要通过使蛋白质分子发生交联而产生作用，因此可原位保存抗原，且对组织穿透性强，收缩性小，是免疫组化应用最广泛的固定液[6]。本实验结果显示，福尔马林固定液对细胞蜡块中细胞质、细胞膜和细胞核的阳性着色及定位影响均较小。因此，在COVID-19疫情期间，不建议做细胞学涂片，建议对新鲜的细胞学标本用福尔马林固定后制作细胞蜡块结合免疫组化结果来进行诊断，从而在预防生物安全感染的基础上保证医疗质量。

工作人员虽然已经采用对细胞学标本进行固定后再操作以减少细胞学生物安全感染，但仍需做好自身防护，这样才能保证医疗生物安全。因此病理细胞室应使用专门通道接收细胞学标本，且接收细胞学标本过程中不应打开密闭包装，密闭包装外表使用75%医用乙醇(或1 000 mg/L的含氯消毒液)进行喷洒消毒(注意保护样本标签)。请注意乙醇和含氯消毒液会使某些标记笔书写消失。接触感染性标本的人员应执行三级防护，至少应着医用防护口罩、帽子、护目镜(或防护面屏)、连体防护服、双层乳胶手套及鞋套，操作完毕后应及时更换外层乳胶手套。完成工作后，应该按照标准步骤脱掉防护用品，并做好手部卫生。剩余的胸、腹腔积液以及痰液应统一放置专门回收容器按照医疗废弃物或者感染废弃物进行处理。每天检测完毕后，工作环境使用紫外线照射消毒1 h，设备表面、台面及地面按规定进行清洁、消毒。

综上所述，作者建议疫情期间病理细胞学标本固定后制作细胞蜡块进行诊断，同时也要做好细胞病理室的生物安全防护。